本发明专利技术公开了一种修饰后可德兰寡糖制备方法及其在影响TTR
【技术实现步骤摘要】
一种化学修饰的聚糖衍生物及其制备和应用
[0001]本专利技术涉及到可德兰衍生物的制备和活性，具体地说是可德兰硫酸化修饰衍生物及其寡糖的制备后作为修饰后低聚合度产物在TTR
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L55P蛋白体外聚集方面的活性研究，属于天然产物化学修饰后衍生物生物活性研究领域。
技术介绍
[0002]可德兰(Curdlan)是由Alcaliges sp.发酵得到的胞外多糖，具有β
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1.3
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D葡聚糖结构，无支链和取代基，聚合度大于250，具有单螺旋、三螺旋和无规卷曲三种构象。可德兰安全无毒，不被人体消化，不发热，具有良好的稳定性、凝固性、增稠性、保水性等特性。成为继黄原胶、结冷胶之后获批的第三种微生物多糖。发酵的胞外多糖用于食品工业。可德兰不溶于水并以悬浮颗粒形式存在。由于可德兰的特殊性质和构象，除用于食品工业外，还具有抗肿瘤、抗寄生虫、抗真菌、抗病毒和免疫调节活性。
[0003]但是，Curdlan水溶性差，几乎不溶，因此其应用不仅受限在食品工业，在医药和环保领域也受到限制。这个缺点可以通过Curdlan的衍生反应来消除。常用的多糖化学修饰方法包括硫酸化、磷酸化、羧甲基化、烷基化、乙酰化和支化糖链连接等。关于Curdlan硫酸化衍生物合成的信息非常稀少。文献中仅给出了通过Curdlan和磷酸在二甲基亚砜
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尿素中反应获得的磷酸盐衍生物。近年来，许多文献报道了Curdlan衍生物还具有重要的生物学活性，如抗肿瘤、抗HIV、抗凝血、抗氧化活性和免疫调节作用。因此，对低聚糖进行化学修饰或降解以提高其溶解度是研究其生物活性的重要方法。
[0004]近年来，大部分研究集中在Curdlan化学修饰后聚糖活性的研究，而对化学修饰后寡糖活性的研究相对较少。获得寡糖的方法包括化学法、物理法和酶法。在物理方法方面，由于产量低、设备昂贵和工艺耗时，这种方法几乎不可能扩大规模。在化学水解条件下，采用浓酸法制备可得寡糖，但这种化学法对环境有害。在酶水解的情况下，可以环保、高产的方式生产Curdlan寡糖及其衍生寡糖。目前，酶促方法几乎用于所有工业过程，是食品和制药行业不可或缺的。
[0005]转甲状腺素蛋白(Transthyretin，TTR)是30种淀粉样蛋白的一种，通过变性和错误折叠能够形成淀粉纤维素。TTR蛋白是一种同源四聚体蛋白，其分子量为55kD。该蛋白主要是在肝脏中合成，之后分泌到脑脊液和血浆中；其中在血浆中的含量较多，达到3.6
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7.2μM。它的主要功能就是携带并运输甲状腺素(Thyroxine，T4)和视黄醇结合蛋白(Retinol Binding Protein，RBP)。
[0006]TTR蛋白基因如果发生了一些遗传性的突变或者在其他环境和因素的影响下，蛋白聚合体变得非常不稳定，四聚体就容易发生解离，形成单体。这些单体TTR立体构象发生变化后会进一步重组形成淀粉蛋白纤维，从而沉积在全身器官、组织或脏器细胞表面和细胞间隙中，引起神经末梢周围自主神经感觉障碍，导致淀粉样疾病或者神经退化性疾病的发生，例如家族性淀粉样多发性神经病变(Familial Amyloidotic Polyneuropathy，FAP)，家族性淀粉样心肌病(Familial Amyloidtic Cardiomyopathy，FAC)，老年性系统性淀粉样
变性(Senile Systemic Amyloidosis，SSA)。全世界范围内有超过100种的TTR基因点突变被发现，其中以V30M TTR(第30位氨基酸由蛋氨酸替代缬氨酸)最为常见，而L55P TTR(第55位氨基酸由脯氨酸替代亮氨酸)是最致命的突变型。目前对于这类疾病的主要治疗方法就是肝移植，但因为这种方法成本昂贵再加上排斥反应带来的副作用等原因，并不是一种理想的治疗手段。所以，越来越多的研究目光放在了开发小分子抑制剂上。之前也被证实小分子结合到TTR蛋白上，可以稳定该蛋白的四聚体结构。但对于小分子天然药物特别是化学修饰后低聚糖对此蛋白的聚集作用研究报道集中于抑制此蛋白解聚，而对于促进此蛋白聚集成大分子量的凝集物方面的报道尚未见到。
技术实现思路
[0007]基于以上
技术介绍
，本专利的目的是提供一种硫酸化可德兰多糖和寡糖，及其制备方法和在淀粉样疾病治疗中的应用。
[0008]本研究的目的通过下述技术方案实现：
[0009]本研究一方面提供硫酸化可德兰寡糖的制备方法，包括以下步骤：
[0010](1)制备硫酸化可德兰：
[0011]量取DMSO于干燥的烧瓶内，放入干燥的磁子幵始剧烈搅拌。称取干燥后可德兰多糖样品1g，缓慢加入，加完后盖上瓶塞，12h磁力搅拌。可德兰多糖完全溶解后，称取三氧化硫－吡啶粉末0.625g，缓慢加入油浴恒温65℃反应体系中，冷凝管回流条件下保持油浴温度反应。待反应结束后，除杂后采用透析袋透析，最终去除溶剂得到固体样品；
[0012](2)制备与分离硫酸化可德兰寡糖：
[0013]以5％(w/v)硫酸化修饰可德兰作为底物，在100ml反应体系中，用0.6mgβ
‑1→3‑
葡聚糖酶在55℃条件下进行降解反应，得到反应产物。反应产物与反应物分离后，最终去除溶剂得到固体样品；
[0014]基于以上技术方案制备硫酸化可德兰寡糖：
[0015]所述步骤(1)透析袋截留分子量为3
‑
5kDa；
[0016]所述步骤(2)中β
‑1→3‑
葡聚糖酶为内切酶；
[0017]所述步骤(1)(2)中去除溶剂方法为溶剂与溶质
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20℃冷冻12h，待完全结冰后进行48h真空冷冻干燥。
[0018]本研究另一方面提供可德兰硫酸化修饰衍生物在TTR
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L55P蛋白体外聚集方面的活性。
[0019]本专利技术公开的具有促进TTR
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L55P蛋白体外聚集方面活性的修饰后可德兰寡糖
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硫酸化可德兰寡糖，聚合度为2
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10,可以显著促进TTR
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L55P蛋白从低聚物状态聚集成纤维状态。具有作为淀粉样疾病药物开发的价值。
[0020]有益效果
[0021]本研究利用可德兰及其衍生物可用于食品工业外，还具有抗肿瘤、抗寄生虫、抗真菌、抗病毒和免疫调节活性的特点；首先，解决了多糖使用物理或化学方法获得寡糖造成的生产率低，设备昂贵，过程耗时和环境污染等问题，并成功制备得到了硫酸化可德兰寡糖，其次研究了该寡糖在TTR
‑
L55P蛋白聚集方面有明显活性，在治疗淀粉样疾病中有应用前景。
附图说明
[0022]图1是实施例1中硫酸化修饰可德兰FT
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IR谱图。
[0023]图2是实施例2中硫酸化修饰可德兰寡糖HPAEC
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PAD产物分析图。
[0024]图3是实施例2中硫酸化修饰可德本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种化学修饰的聚糖衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备硫酸化可德兰：量取80
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120mlDMSO于容器内搅拌，加入可德兰多糖样品0.8
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1.2g，密闭容器口，磁力搅拌12
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16h；体系恒温60
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70℃，加入三氧化硫吡啶粉末0.5
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0.7g，回流反应0.5
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1.5h；过滤，收集滤液采用透析袋透析2
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3天，最终透析袋内的物料去除溶剂得到硫酸化修饰可德兰；(2)制备与分离硫酸化可德兰寡糖：以80
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120ml5％(w/v，mg/ml)硫酸化修饰可德兰的水溶液作为底物，用0.5
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0.7mgβ
‑1→3‑
葡聚糖酶在50
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60℃条件下进行降解反应1
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24小时，得到反应产物；反应产物用超滤膜过滤，滤液去除溶剂得到硫酸化可德兰寡糖。2.根据权利要求1所述的化学修饰的可德兰寡糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述透析袋截留分子量为3
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【专利技术属性】
技术研发人员：尹恒，陈璐洁，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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