一种适用于神经干细胞大规模消化的消化方法技术

本发明专利技术公开了一种适用于神经干细胞大规模消化的消化方法，操作步骤如下：细胞球收集、加入Accutase酶、三通阀和第一注射器组装、机械吹打解离、安装注射泵、消化终止、单细胞离心、细胞重悬、细胞计数。本发明专利技术的这种Accutase酶与机械消化装置结合的消化方式解决了神经干细胞大规模培养消化的技术稳定性及均一性的技术问题，可在较短时间内获取大量高质量的神经干细胞，可用于实验研究、生产应用或其他作用。本发明专利技术操作简便，人力需求少，扩增效率高，神经干细胞生长状态好，对神经干细胞的大规模培养及应用具有重要意义。规模培养及应用具有重要意义。规模培养及应用具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种适用于神经干细胞大规模消化的消化方法


[0001]本专利技术涉及实验室技术和设备领域，确切地说是一种适用于神经干细胞大规模消化的消化方法。

技术介绍

[0002]神经干细胞（NSCs)是一类居于自我更新能力，能够分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的多潜能细胞。NSCs移植到体内后，可通过神经细胞替代方式，重新链接受损的神经环路；通过旁分泌效应，释放免疫因子，促进神经损伤修复，为临床治疗神经退行性疾病提供了新的途径。因此，对间神经干细胞进行体外大规模培养，可以提供至关重要的医学材料。在神经干细胞进行体外大规模培养过程中，细胞消化是关键环节。
[0003]神经干细胞现行消化手段为手动吹打消化，即用移液枪吸取细胞液吹打利用剪切力使细胞球解离成为单细胞。
[0004]然而这些消化方式分别存在如下问题：1.手动消化：会受操作人限制，消化细胞个体差异性较大且消化程度不可控；2.机械消化：细胞球直径大小差异大, 小细胞球被吹打为单细胞时, 大直径细胞球仍未吹打开，并且不适合大规模消化神经干细胞。
[0005]因此专利技术此种消化方式进行神经干细胞大规模培养中的消化操作，用以解决上述单纯手动消化、单纯机械消化消化过程中存在的问题。
[0006]现有技术检索可知：CN201380022394.4细胞培养系统和细胞培养方法，细胞培养系统具备：细胞培养槽；成分调整液储存槽；培养液成分调整部件，其具有细胞培养液的入口和出口；入口连接送液回路，其自细胞培养槽连接到培养液成分调整部件的入口；出口连接送液回路，其自细胞培养槽连接到培养液成分调整部件的出口；灌注部件，其用于将细胞培养液自入口连接送液回路经由培养液成分调整部件灌注到出口连接送液回路；以及调整部件，其用于调整细胞培养槽的液量，其中，该细胞培养系统能够借助培养液成分调整部件对细胞培养槽内的细胞培养液的成分和成分调整液储存槽内的成分调整液的成分连续地进行调整并能够以使细胞培养槽内的细胞培养液的量为实质上恒定的方式调整细胞培养槽内的细胞培养液的量。

技术实现思路

[0007]本专利技术要解决的技术问题是1.手动消化：会受操作人限制，消化细胞个体差异性较大且消化程度不可控；2.机械消化：细胞球直径大小差异大, 小细胞球被吹打为单细胞时, 大直径细胞球仍未吹打开，并且不适合大规模消化神经干细胞。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术手段：一种适用于神经干细胞大规模消化的消化方法，操作步骤如下：步骤1：细胞球收集：将神经干细胞干细胞收集于离心管或离心瓶中，离心管或离心瓶中的神经干细胞干细胞50g，在室温状态下通过离心机离心5min；
步骤2：加入Accutase 酶：轻敲离心管底部，使细胞球沉淀分散，分别向洗涤沉淀管和细胞沉淀管沿管壁转圈加入Accutase 酶，观察确认细胞球沉淀分散；步骤3：三通阀和第一注射器组装：将连接三通阀的第一注射器顶部注射针头伸入细胞沉淀管中吸取全部细胞球悬液，三通阀右侧通道打开，第一注射器插入三通阀右侧通道中，放置于恒温震荡箱中，设置于恒温震荡箱的参数为37摄氏度、120rpm震荡20分钟；步骤4：机械吹打解离：三通阀打开上方通道，第二注射器安装好针头后吸取1mL消化酶使注射器乳头部分充满消化酶；取下针头，第二注射器安装在三通阀上方通道；步骤5：安装注射泵：将三通阀三个通路均封锁，安装注射泵，打开三通阀第一注射器和第二注射器两个通路，启动注射泵；步骤6：消化终止：三通阀锁住三个出口，拆下注射泵和第一注射器，将第一注射器内细胞液打入离心管中；步骤7：单细胞离心：离心管中细胞液300g，在室温状态下通过离心机离心；步骤8：细胞重悬：轻敲离心管底部，使细胞沉淀松散；步骤9：细胞计数：利用细胞计数仪记录细胞细胞活率，结团率，活细胞密度，总细胞密度，计算细胞扩增倍数。
[0009]作为优选，本专利技术更进一步的技术方案是：所述的细胞球收集中冲洗残留细胞，至肉眼可见细胞球残留不超过30个，若洗涤过程中细胞球残留明显，可轻拍瓶壁帮助细胞球重悬。
[0010]所述的细胞球收集中，完成离心后用细胞沉淀管将培养液上清转移至标记好的无菌瓶中保存，标注液体体积；洗涤液用洗涤移液管至废液缸中。
[0011]所述的细胞沉淀管和洗涤移液管均为50mL移液管。
[0012]所述的三通阀和第一注射器组装中吸取全部细胞球悬液后注射器针口向上倒吸2mL,收集针头内液体，并在第一注射器内留够2.5mL空气，后将第一注射器倒立放置于台面上；所述的三通阀和第一注射器组装中震荡过程中每5分钟将三通阀和第一注射器组装180度旋转一次。
[0013]所述的三通阀和第一注射器组装、机械吹打解离中第一注射器和第二注射器均为10mL注射器。
[0014]所述的安装注射泵中启动注射泵时注射泵控制面板选择注射器选型为30mL，调节参数设置为126mm/min，吹吸循环30次，输入注射器刻度显示的体积，吹吸30次后观察消化液状态。
[0015]所述的消化终止的离心管需加入生理盐水，将细胞液打入离心管中后，第一注射器吸取10mL生理盐水，连接三通阀，手动吹打5次，冲洗管路。
[0016]所述的单细胞离心中完成离心工序后，倾倒弃上清，用1mL移液器吸弃离心管口残留液体，防止液体回流。
[0017]所述的细胞重悬中离心管加入1mL完全培养液，匀速吹打5
‑
8次，至没有可见细胞团块；用10mL移液管加入完全培养基，匀速吹打。
[0018]本专利技术的这种Accutase酶与机械消化装置结合的消化方式解决了神经干细胞大规模培养消化的技术稳定性及均一性的技术问题，可在较短时间内获取大量高质量的神经干细胞，可用于实验研究、生产应用或其他作用。本专利技术操作简便，人力需求少，扩增效率
高，神经干细胞生长状态好，对神经干细胞的大规模培养及应用具有重要意义。
附图说明
[0019]图1为本专利技术的一种具体实施例的结构示意图。
[0020]图2为本专利技术的另一种具体实施例的结构示意图。
[0021]附图标记说明：1－第一注射器；2－第二注射器；3－三通阀；4－注射泵。
具体实施方式
[0022]下面结合实施例，进一步说明本专利技术。
[0023]具体实施例1：1.一种适用于神经干细胞大规模消化的消化方法，其特征在于：操作步骤如下：步骤1：细胞球收集：将神经干细胞干细胞收集于离心管或离心瓶中，离心管或离心瓶中的神经干细胞干细胞50g，静置五分钟，在室温状态下通过离心机离心；细胞球收集中冲洗残留细胞，至肉眼可见细胞球残留不超过30个，若洗涤过程中细胞球残留明显，可轻拍瓶壁帮助细胞球重悬；细胞球收集中，完成离心后用细胞沉淀管将培养液上清转移至标记好的无菌瓶中保存，标注液体体积；洗涤液用洗涤移液管至废液缸中；细胞沉淀管和洗涤移液管均为50mL移液管；步骤2：加入Accutase 酶：轻敲离心管底部，使细胞球沉淀分散，分别向洗涤沉淀管和细胞沉淀管沿管壁转圈加入Accutase 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于神经干细胞大规模消化的消化方法，其特征在于：操作步骤如下：步骤1：细胞球收集：将神经干细胞干细胞收集于离心管或离心瓶中，离心管或离心瓶中的神经干细胞干细胞50g，在室温状态下通过离心机离心5min；步骤2：加入Accutase酶：轻敲离心管底部，使细胞球沉淀分散，分别向洗涤沉淀管和细胞沉淀管沿管壁转圈加入Accutase 酶，观察确认细胞球沉淀分散；步骤3：三通阀和第一注射器组装：将连接三通阀的第一注射器顶部注射针头伸入细胞沉淀管中吸取全部细胞球悬液，三通阀右侧通道打开，第一注射器插入三通阀右侧通道中，放置于恒温震荡箱中，设置于恒温震荡箱的参数为37摄氏度、120rpm震荡20分钟；步骤4：机械吹打解离：三通阀打开上方通道，第二注射器安装好针头后吸取1mL消化酶使注射器乳头部分充满消化酶；取下针头，第二注射器安装在三通阀上方通道；步骤5：安装注射泵：将三通阀三个通路均封锁，安装注射泵，打开三通阀第一注射器和第二注射器两个通路，启动注射泵；步骤6：消化终止：三通阀锁住三个出口，拆下注射泵和第一注射器，将第一注射器内细胞液打入离心管中；步骤7：单细胞离心：离心管中细胞液300g，在室温状态下通过离心机离心；步骤8：细胞重悬：轻敲离心管底部，使细胞沉淀松散；步骤9：细胞计数：利用细胞计数仪记录细胞细胞活率，结团率，活细胞密度，总细胞密度，计算细胞扩增倍数。2.根据权利要求1所述的一种适用于神经干细胞大规模消化的消化方法，其特征在于：所述的细胞球收集中冲洗残留细胞，至肉眼可见细胞球残留不超过30个，若洗涤过程中细胞球残留明显，可轻拍瓶壁帮助细胞球重悬。3.根据权利要求1所述的一种适用于神经干细胞大规模消化的消化方法，其特征在于：所述的细胞球收集中，完成离心后用细胞沉淀管将培养液上清转移至标记好的无菌瓶中保存，标注液体...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宏君，陈小威，杨印祥，周莹，张文营，穆乾，郭迎，
申请(专利权)人：银丰生物工程集团有限公司，
类型：发明
国别省市：