一种原代奶绵羊乳腺上皮细胞的分离培养方法技术

本发明专利技术公开了一种奶绵羊乳腺上皮细胞的分离培养方法，奶绵羊乳腺上皮细胞株的构建包括以下步骤：将泌乳期的奶绵羊乳腺组织经过消毒清洗后，剪成肉糜状，加入酶消化液消化后，将消化离心后得到的细胞接种在T25培养瓶中进行培养，1~2d后可以观察到呈“岛屿”状细胞长出，4~5d后大量呈鹅卵石状的乳腺上皮细胞成簇生长并汇合时进行传代。传代时利用差速消化法去除成纤维细胞，获得纯度高的奶绵羊乳腺上皮细胞株。为深入开展乳脂、乳蛋白表达及奶绵羊泌乳机制的细胞水平硏究，及作为制作乳腺生物反应器的靶细胞提供了试验材料与技术支持。器的靶细胞提供了试验材料与技术支持。

【技术实现步骤摘要】
一种原代奶绵羊乳腺上皮细胞的分离培养方法


[0001]本专利技术属于细胞培养的
，具体而言，涉及以取自活体东弗里生奶绵羊乳腺组织为材料，一种原代奶绵羊乳腺上皮细胞的分离培养方法。

技术介绍

[0002]研究报告表明，单位体积的绵羊奶营养价值远高于牛奶和山羊奶。世界绵羊品种中，产奶性能最好的是东佛里生羊。乳腺上皮细胞是一种高度分化的体细胞，但其在体外培养条件下仍可保持合成和分泌乳汁的功能，因此可作为靶细胞被用于乳腺生物反应器的制作，即利用体外培养的乳腺上皮细胞，基于转基因技术平台使外源基因导入动物基因组中并定位表达于动物乳腺，在动物的乳汁中生产一些具有重要价值产品，如小分子多肽或蛋白质。同时，乳腺上皮细胞也是从细胞水平研究乳蛋白表达、乳腺发育和泌乳机制以及作为抗病转基因育种供体细胞的有利工具。另外，乳腺炎是世界范围内乳品行业最常见和危害最大的疾病。乳腺炎所带来的危害引导着国内外学者对乳腺炎从病因、发病机理、诊断、治疗以及预防等多角度、多方面进行了深入的研究，而对乳腺炎的研究最为常用的就是建立体外乳腺上皮细胞感染的乳腺炎细胞模型。所以奶绵羊乳腺上皮细胞的分离培养方法对奶绵羊的泌乳机制及乳腺炎机制等相关研究提供了试验材料。
[0003]乳腺上皮细胞常用的四种分离培养方法是组织块培养法、酶消化培养法、机械破碎法和乳汁分离法。组织块培养方法是直接无菌采取动物的乳腺组织，剪成l mm3左右小块直接接种于培养皿，此方法操作较为简单，但缺点是耗时长，一般1周左右时间才有细胞迁出,而且往往是成纤维细胞最先迁出生长,需传代数次后进一步纯化处理，传代次数的过多极易导致乳腺上皮细胞的老化，且乳腺组织中残存的乳汁很容易造成污染。酶消化培养法是将组织块剪碎后加入胶原酶、胰蛋白酶或透明质酸酶等处理，过滤离心后可得细胞悬液，置于培养皿内贴壁培养，但缺点是此方法对于酶的选择及消化时间比较难于掌握,消化不足则不易获得可用于足以扩大再培养的细胞数量,消化过度会导致细胞的损伤，无法成功贴壁。机械破碎法就是通过物理学处理手段,将组织块解离成分散的细胞后用滤网过滤,离心弃去上清液,用培养液悬浮后接种培养,单一使用该方法对乳腺上皮细胞这种分化程度较高的细胞易造成伤害,细胞的存活率相对较低。乳汁分离法是将新鲜的乳汁在离心机内重复离心，多次后可得到肉眼可见的一部分沉淀进行培养，沉淀中含有细胞团块，该方法分离的乳腺上皮细胞虽然没有成纤维细胞的污染, 但是因为乳汁中乳腺上皮细胞含量少,且为自然脱落的细胞,组胞活性差,很难维持生长，且多次重复离心对细胞本身会造成一定的损伤。
[0004]细胞培养液是用于维持细胞体外生长的营养物质，到目前为止，用于奶绵羊乳腺上皮细胞的培养液未见报道。另外，通过原代奶绵羊乳腺上皮细胞的分离培养方法在现有技术中未见报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于通过研究原代奶绵羊乳腺上皮细胞的分离培养方法，从而获得原代奶绵羊乳腺上皮细胞株，为开展奶绵羊的分子生物学和细胞生物学的相关研究提供了试验材料。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种原代奶绵羊乳腺上皮细胞的分离培养方法，奶绵羊乳腺上皮细胞株的构建包括以下步骤：（1）将从羊场采集回来的新鲜奶绵羊乳腺组织进行简单的清理之后，从组织中间层中剪下适当（黄豆大小）的乳腺组织，尽量将组织周围的脂肪组织和结缔组织等剪掉；（2）将乳腺组织用生理盐水清洗干净（直至生理盐水洗液清澈），将洗好的乳腺组织放入盛有生理盐水的干净烧杯中；（3）在生物安全柜中进行操作，按如下顺序将组织清洗：含3%双抗（PS）的PBS浸泡清洗、75%酒精中浸泡40~60s、含 3% PS 的PBS浸泡清洗，含 3% PS 的PBS浸泡清洗，含2% PS的PBS清洗约10s；（4）在一次性培养皿中将乳腺组织剪至肉糜状，在剪切过程中需用含3% PS的PBS不断清洗乳腺组织，防止在剪切过程中组织变干；（5）将剪至肉糜状的组织转移到50mL离心管中，加入5mL含3 %PS的PBS，吹打清洗后，室温静置30 min；（6）弃掉上清，加入配好的酶消化液，每管加入10mL酶消化液，37℃摇床中以转速70rpm，消化40min—1h；（7）消化结束后，在生物安全柜中，用枪吹打5min，静置2min后，将细胞消化液上清导入新的50mL离心管中；（8）细胞消化液中加入终止培养基终止消化，2000rpm离心3min，收集从组织中消化下来的细胞；（9）弃掉上清，向剩余的沉淀中加入终止培养基，重悬沉淀，2000rpm离心3min；（10）弃掉上清，加入5mL的完全培养基，重悬细胞沉淀，将细胞悬液分装到T25培养瓶中，放入细胞培养箱中培养90~120min；（11）将培养液换入新的T25培养瓶中，原瓶中加入新完全培养基，完成差速贴壁来纯化乳腺上皮细胞和成纤维细胞。
[0007]本专利技术的目的还可以这样实现：所述的双抗（PS）是终浓度为 ：100IU/mL 的青霉素和 100IU/mL 的链霉素；所述的酶消化液的配制：49mL的PBS中加入500μl的型胶原酶和500μL透明质酸酶；所述的终止培养基的配制：DME/F
‑
12 基础培养基，加入 5%胎牛血清 (FBS)，2% PS；所述完全培养基的配制：DME/F
‑
12 基础培养基，加入 20%胎牛血清 (FBS)，2% PS，牛胰岛素（5 μg/mL），氢化可的松（5 μg/mL），EGF（10 ng/mL）；所述培养箱为 37
°
C、含 5%CO2的饱和湿度空气的二氧化碳培养箱。
[0008]与现有技术相比，本专利技术涉及的原代奶绵羊乳腺上皮细胞的分离和培养方法具有以下优点和显著进步：
（1）本专利技术通过研究原代奶绵羊乳腺上皮细胞的分离和培养方法，进而获得了原代奶绵羊乳腺上皮细胞株,为开展奶绵羊的分子生物学和细胞生物学的相关研究提供了试验材料；（2）本专利技术在进行组织块贴壁法原代培养时, 根据上皮细胞与成纤维细胞对胰酶（0.25%，含 EDTA）消化敏感性的不同及二者贴壁强度的差异，将二者分离、纯化。具体而言，通过控制合适的消化时间使成纤维细胞脱壁，而上皮细胞因脱壁较慢仍贴在培养瓶壁上，分瓶培养后，只需经过几次传代就可以得到纯化奶绵羊乳腺上皮细胞；（3）采用本专利技术方法获得具有旺盛的增殖能力的奶绵羊乳腺上皮细胞，可用于研究乳脂、乳蛋白表达及奶绵羊泌乳机制的细胞水平硏究，也可作为制作乳腺生物反应器的靶细胞。
附图说明
[0009]图1由酶消化法分离出的原代奶绵羊乳腺上皮细胞，呈“岛屿”状。
[0010]图2未纯化的奶绵羊乳腺上皮细胞，A:奶绵羊乳腺上皮细胞，B:成纤维细胞。
[0011]图3纯化后的奶绵羊乳腺上皮细胞。
[0012]图4 RT
‑
PCR 检测奶绵羊乳腺上皮细胞特异性基因，1：角蛋白8基因RT
‑
PCR扩增产物条带，条带大小为534bp；2：角蛋白18基因RT
‑
PCR扩增产物条带，条带大小为506bp；a本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种原代奶绵羊乳腺上皮细胞的分离培养方法，奶绵羊乳腺上皮细胞株的构建包括以下步骤：（1）将从羊场采集回来的新鲜奶绵羊乳腺组织进行简单的清理之后，从组织中间层中剪下适当（黄豆大小）的乳腺组织，尽量将组织周围的脂肪组织和结缔组织等剪掉；（2）将乳腺组织用生理盐水清洗干净（直至生理盐水洗液清澈），将洗好的乳腺组织放入盛有生理盐水的干净烧杯中；（3）在生物安全柜中进行操作，按如下顺序清洗乳腺组织：含3%双抗（PS）的PBS浸泡清洗、75%酒精中浸泡40~60s、含 3% PS 的PBS浸泡清洗、含 3% PS 的PBS浸泡清洗、含2% PS的PBS清洗约10s；（4）在一次性培养皿中将乳腺组织剪至肉糜状，在剪切过程中需用含3% PS的PBS不断清洗乳腺组织，防止在剪切过程中组织变干；（5）将剪至肉糜状的组织转移到50mL离...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，
申请(专利权)人：白林峰王志钢，
类型：发明
国别省市：