一种DNA腺嘌呤甲基转移酶活性检测方法技术

本发明专利技术涉及一种DNA腺嘌呤甲基转移酶活性检测方法，根据底物发卡在DNA腺嘌呤甲基转移酶和限制性核酸内切酶的双酶偶联作用下得到一条截短发夹结构，并设计含有RNA切割型DNA模拟酶互补序列的滚环探针，以截短发卡结构为引物，以滚环探针为模板进行滚环扩增，得到的RNA切割型DNA模拟酶切割分子信标，使修饰在分子信标两端的荧光基团和淬灭基团远离，释放荧光信号，实现DNA腺嘌呤甲基转移酶活性的检测，检测限低至3.09

【技术实现步骤摘要】
一种DNA腺嘌呤甲基转移酶活性检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种DNA腺嘌呤甲基转移酶活性检测方法。

技术介绍

[0002]DNA甲基化是在DNA甲基转移酶催化下，甲基从供体S
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腺苷甲硫氨酸转移并共价结合到基因组CpG二核苷酸胞嘧啶的C5或N4位，或5'
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G
‑
A
‑
T
‑
C
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3'四核苷酸腺嘌呤N6位的生物过程。DNA甲基化可以在不改变DNA序列的情况下改变遗传性能，因此在生物进化中起着至关重要的作用。然而，异常的DNA甲基化可导致肿瘤发生。在生物体内存在两种异常的DNA甲基化，即超甲基化和低甲基化。如DNA超甲基化与小细胞肺癌、乳腺癌和颈癌等癌症相关。同时，低甲基化与乳腺癌、脑癌和宫颈癌等多种癌症相关。因此，DNA甲基转移酶的活性具有作为医学疾病诊断和预后的参考的潜力。DNA甲基转移酶活性的常规测定包括高效液相色谱(HPLC)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性标记法和甲基化特异性PCR。尽管这些方法已在实验室广泛用于筛选DNA甲基转移酶活性，然而，这些方法对操作者专业度要求高，成本高，准确度低，检测限高，并且需要对样品做预处理等，限制了其在实践中的进一步应用。
[0003]荧光生物传感器因其具备良好的选择性，高稳定性，高特异性，高灵敏度等优点而受到广泛的关注。荧光生物传感器包括分子识别部分和信号转换部分，分子识别部分识别靶标，而后将生物信号转换成荧光信号。目前，已经开发了许多基于荧光信号的生物传感器，有酶联免疫法，小分子修饰法和生物酶法等，但目前还存在检测限高，特异性弱等问题。
[0004]DNA滚环扩增是一种DNA恒温扩增的方法，以一个DNA环状结构为模板，一条单链DNA作为引物，在DNA聚合酶的作用下进行核酸等温扩增反应。与PCR方法相比，滚环扩增的反应条件更温和，扩增效率更高。DNA模拟酶是由DNA组成具有一定功能的序列片段，如具有催化模拟酶G
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四联体和RNA切割型DNA模拟酶。人工合成DNA片段成本较高，将DNA模拟酶的互补序列嵌入到DNA滚环扩增的模板链中，通过滚环扩增反应可以将目标片段进行循环扩增，是一种高效的DNA模拟酶生产方法。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种基于滚环扩增和RNA切割型DNA模拟酶技术的对DNA腺嘌呤甲基转移酶检测的方法，其具有高灵敏、高特异性、测定准确等优点。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种DNA腺嘌呤甲基转移酶活性检测方法，包括以下步骤：
[0007]S1、将底物发卡探针序列变性、复性形成发卡结构，分别将发卡结构与不同活性的DNA腺嘌呤甲基转移酶孵育，孵育后加入限制性核酸内切酶，继续孵育得到含有切割产物的混合物；
[0008]S2、以S1得到的切割产物为引物，以含有RNA切割型DNA模拟酶互补序列的滚环探针为模板进行滚环扩增，得到含有扩增产物的混合物；
[0009]所述扩增产物为含有RNA切割型DNA模拟酶的序列；
[0010]S3、向含有扩增产物的混合物中加入分子信标进行孵育，建立荧光信号与DNA腺嘌呤甲基转移酶活性的关系曲线；
[0011]S4、将待测样品按照S1
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S3进行操作，测出荧光强度，根据S3的关系曲线计算出DNA腺嘌呤甲基转移酶的活性。
[0012]进一步地，所述滚环探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0013]进一步地，所述底物发卡探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0014]进一步地，所述限制性核酸内切酶为限制性核酸内切酶Dpn I。
[0015]进一步地，所述分子信标的两端分别修饰有荧光基团和淬灭基团。
[0016]进一步地，将切割产物与滚环探针变性、复性形成互补结构，加入扩增体系中进行滚环扩增。
[0017]进一步地，所述扩增体系包括Phi 29DNA聚合酶、dNTP和Tris
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HCl缓冲液。
[0018]进一步地，Tris
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HCl缓冲液的组成为：45
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55mM Tris,95
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105mM NaCl,15
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25mM MgCl2,195
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205mM KCl。
[0019]进一步地，步骤S1的孵育体系中包括S
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腺苷甲硫氨酸。
[0020]进一步地，所述分子信标的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，为ACATG/rA/TGGTTA。
[0021]进一步地，滚环探针由核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的模板探针与核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的连接探针变性、复性，加入T4 DNA连接酶，形成环状结构后加入EXO I和EXO III消化多余单链得到。
[0022]本专利技术检测体系的构建包括：底物发夹的设计，DNA模板探针的设计，分子信标的设计，DNA腺嘌呤甲基转移酶和限制性核酸内切酶的双酶偶联作用，DNA滚环扩增的进行，RNA切割型DNA模拟酶的切割作用和荧光强度测定。检测原理如下：底物发卡探针(HP)在DNA腺嘌呤甲基转移酶和限制性核酸内切酶的双酶偶联作用下形成一条短的发卡结构(sHP)。将sHP和DNA环状模板混合后高温变性再退火，加入Phi 29DNA聚合酶和dNTP后，进行DNA滚环扩增反应得到一条含有RNA切割型DNA模拟酶的单链DNA。在加入分子信标后，RNA切割型DNA模拟酶将分子信标切割，产生荧光信号。最后，建立荧光信号强度与DNA腺嘌呤甲基转移酶活性之间的线性关系，利用该标准曲线计算样品中靶标的活性。当体系中没有DNA腺嘌呤甲基转移酶存在时，未甲基化的HP不能被限制性核酸内切酶Dpn I切割，DNA滚环扩增由于没有引物无法进行，分子信标不会被切割即没有荧光信号产生。
[0023]借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：
[0024]本专利技术通过设计能被DNA腺嘌呤甲基转移酶甲基化并被限制性内切酶Dpn I切割的HP序列和嵌入RNA切割型DNA模拟酶互补序列的DNA环状模板，利用DNA滚环扩增反应和RNA切割型DNA模拟酶技术将分子信标进行切割，产生大量的荧光信号。当DNA腺嘌呤甲基转移酶不存在时，HP序列不会被切割，使DNA滚环扩增没有引物而无法进行，进而导致没有RNA切割型DNA模拟酶的生成，无法产生荧光信号。并且只有当HP被体系中存在的DNA腺嘌呤甲基转移酶甲基化后，才会被限制性内切酶Dpn I切割从而使后续反应可以进行。与检测DNA腺嘌呤甲基转移酶的传统方法相比，毒性低，特异性强，灵敏度高。
[0025]上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
[0026]为了本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA腺嘌呤甲基转移酶活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将底物发卡探针序列变性、复性形成发卡结构，分别将发卡结构与不同活性的DNA腺嘌呤甲基转移酶孵育，孵育后加入限制性核酸内切酶，继续孵育得到含有切割产物的混合物；S2、以S1得到的切割产物为引物，以含有RNA切割型DNA模拟酶互补序列的滚环探针为模板进行滚环扩增，得到含有扩增产物的混合物；所述扩增产物为含有RNA切割型DNA模拟酶的序列；S3、向含有扩增产物的混合物中加入分子信标进行孵育，建立荧光信号与DNA腺嘌呤甲基转移酶活性的关系曲线；S4、将待测样品按照S1
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S3进行操作，测出荧光强度，根据S3的关系曲线计算出DNA腺嘌呤甲基转移酶的活性。2.根据权利要求1所述的DNA腺嘌呤甲基转移酶活性检测方法，其特征在于：所述滚环探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的DNA腺嘌呤甲基转移酶活性检测方法，其特征在于：所述底物发卡探针序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求1所述的DNA腺嘌呤甲基转移酶活性检测方法，其特征在于：所述分子信标的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。5.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：周楠迪，陈灏翰，张雨婷，王晓丽，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：