一种可特异性识别细胞色素氧化酶CYP3A4的近红外荧光分子探针及其制备与应用制造技术

一种可特异性识别细胞色素氧化酶CYP3A4的近红外荧光分子探针及其制备与应用，所述荧光分子探针具有式Ⅰ所示结构式：该探针本身没有荧光，在与细胞色素氧化酶CYP3A4反应后生产的羟化产物具有荧光，其最大发射波长处于近红外区，达到721nm，能够减少背景荧光干扰、且光损伤更小、组织穿透性更好，可用于各种重组CYP3A4、各类组织细胞中CYP3A4酶活力的测定，以及CYP3A4抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。量评价。量评价。

【技术实现步骤摘要】
一种可特异性识别细胞色素氧化酶CYP3A4的近红外荧光分子探针及其制备与应用


[0001]本专利技术涉及一种有机小分子荧光探针，具体涉及一种可特异性识别细胞色素氧化酶CYP3A4的近红外荧光分子探针及其制备与应用，属于生物传感


技术介绍

[0002]细胞色素P450(CYP)是一个很大的可自身氧化的亚铁血红素蛋白家族，属于单氧酶的一类，因其在450纳米有特异吸收峰而得名。它参与内源性物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢。根据氨基酸序列的同源程度，其成员又依次分为家族、亚家族和酶个体三级。其中，CYP3A4在肝脏中丰度高，底物谱广，被认为是人类最重要的CYP同工型，有助于超过50％的临床药物代谢。不幸的是，CYP3A4活性会受到许多临床药物的影响，导致药物不良相互作用的发生，甚至危及生命。因此，迫切需要开发能够实时监测CYP3A4活性的技术以准确表征生物系统内CYP3A4的活性。
[0003]目前，已有包括质谱或高效液相色谱法等传统检测方法被开发，但是由于存在操作步骤复杂、成本高昂、需要对细胞或组织进行裂解等预处理等缺陷，限制了其在活细胞或体内中的进一步应用。与之相比，荧光分析法因其优异的灵敏度和特异性，特别是能够实现实时无创的细胞/组织成像等优势受到了广泛关注。其中，与紫外/可见光(＜700nm)区域的光相比，近红外光(700～900nm)对生物样品的光损伤更小、组织穿透性更好以及来自受到复杂生命系统自发荧光的干扰更弱，因此更适合生物成像。
[0004]如申请号CN202111426695.6、名称为“一种检测细胞色素氧化酶CYP3A的广谱型荧光探针的应用”和申请号CN201910158458.2、名称为“一种检测细胞色素氧化酶CYP3A4的双光子型荧光探针的应用”的专利技术专利虽然都可以检测细胞色素氧化酶CYP3A4，但是其发射波长都较短，抗干扰能力较弱，因此，开发可特异性识别细胞色素氧化酶CYP3A4的近红外荧光分子探针具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对当前检测细胞色素氧化酶CYP3A4的荧光分子探针抗干扰能力不强的问题，提出了一种可特异性识别细胞色素氧化酶CYP3A4的近红外荧光分子探针及其制备与应用，其最大发射波长处于近红外区，达到721nm，能够减少背景荧光干扰、且光损伤更小、组织穿透性更好。
[0006]本专利技术为解决上述问题所采用的技术手段为：一种可特异性识别细胞色素氧化酶CYP3A4的近红外荧光分子探针，具有式Ⅰ所示的结构式：
[0007][0008]一种可特异性识别细胞色素氧化酶CYP3A4的近红外荧光分子探针的制备，方法如下：
[0009](1)将色酮
‑3‑
甲醛、溴代乙醛缩乙二醇三苯基膦盐加入二氯甲烷中，室温下搅拌30min后，加入NaOH溶液，继续搅拌3h后，加入浓盐酸，继续搅拌30min，将反应体系倒入水中，二氯甲烷萃取，合并、干燥有机层，减压浓缩，柱层析纯化，得到化合物Ⅰ；其中色酮
‑3‑
甲醛与溴代乙醛缩乙二醇三苯基膦盐的摩尔比为1:1.1～1:1.5，色酮
‑3‑
甲醛与二氯甲烷的用量比为1:3～1:10mmol/mL，色酮
‑3‑
甲醛与NaOH的摩尔比为1:1～1:2，色酮
‑3‑
甲醛与浓盐酸的用量比为1:2～1:2.5mmol/mL，NaOH溶液浓度为1mmol/mL；
[0010](2)将化合物Ⅰ、2
‑
甲基吡啶盐、哌啶溶于甲醇、乙醇等醇性溶剂，90℃加热回流至结束，旋转蒸发除去溶剂，经柱层析纯化，得式Ⅰ所示荧光分子探针；其中化合物Ⅰ与2
‑
甲基吡啶盐的摩尔比为1:1.1～1:1.5，化合物Ⅰ与哌啶的摩尔比为5:1～8:1，化合物Ⅰ与溶剂的用量比为1:7～1:10mmol/mL:
[0011][0012]本专利技术提供可特异性识别细胞色素氧化酶CYP3A4的新型近红外荧光分子探针及其应用，该探针没有荧光，其羟化产物具有荧光，其最大发射波长处于近红外区(最大发射波长为721nm)，可采用荧光检测器细胞色素氧化酶CYP3A4的特异性检测，检测原理如下所示：
[0013][0014]该特异性探针其在CYP3A4活性检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种重组CYP3A4、各类组织细胞中CYP3A4酶活力的测定，以及CYP3A4抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。
[0015]本专利技术的有益效果是：
[0016]1.本专利技术提供的荧光分子探针可与CYP3A4进行特异性作用，产生荧光光谱的变化，而与其他物质作用均不能导致荧光光谱的明显改变，从而实现对CYP3A4的定量、特异性识别。
[0017]2.本专利技术提供的荧光分子探针合成步骤简单，原料易得，检测方法简便，成本低廉。
[0018]3.本专利技术提供的荧光分子探针的最大发射波长位于近红外区，具有生物组织光吸收或自身光强度小、对生物组织穿透能力较强、成像信噪比和分辨率较高的优点，同时具有良好的水溶性，更有利于各类组织细胞中CYP3A4酶活力的测定。
附图说明
[0019]图1.本专利技术实施中荧光分子探针的荧光强度随CYP3A4浓度变化的发射光谱图；
[0020]图2.本专利技术实施中荧光分子探针的荧光强度和CYP3A4浓度的线性关系；
[0021]图3.本专利技术实施中荧光分子探针对CYP3A4的选择性图；
[0022]图4.本专利技术实施中荧光分子探针在HepG2细胞内荧光共聚焦成像图，其中a)为细胞用10μM酮康唑处理30min后，用50μM探针处理；b)为细胞用10μM利福平处理30min后，用50μM探针处理。
具体实施方式
[0023]下面结合附图对本专利技术进一步说明。
[0024]实施例一
[0025]化合物Ⅰ的合成
[0026]将色酮
‑3‑
甲醛(870.78mg，5mmol)和溴代乙醛缩乙二醇三苯基膦盐(2361.10mg，5.5mmol)置于100mL圆底烧瓶中，加入25mL CH2Cl2，使其完全溶解，室温下搅拌30min。然后将5mL NaOH溶液(1.5g，5mmol)缓慢加入反应体系中。搅拌3h后，加入10mL浓盐酸，继续搅拌30min，将反应体系倒入水中，用CH2Cl2萃取。合并有机层、用无水硫酸钠干燥后，再经真空浓缩，最后用柱层析进行分离纯化，得到化合物757.73mg，产率为75.7％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):9.68(s,1H),8.08(d,J＝8.0Hz,1H),7.74(t,J＝7.9Hz,1H),7.58(d,J＝8.2Hz,1H),7,47
‑
7.44(m,2H),6.72(s,1H),6.29(d,J＝6.8Hz,1H)。
[0027]式Ⅰ所示化合物的合成
[0028]在50mL的圆底烧瓶中加入化合物Ⅰ(600.58mg,3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可特异性识别细胞色素氧化酶CYP3A4的近红外荧光分子探针，其特征在于：具有式Ⅰ所示的结构式：2.一种权利要求1所述的可特异性识别细胞色素氧化酶CYP3A4的近红外荧光分子探针的制备，其特征在于：方法如下：(1)将色酮
‑3‑
甲醛、溴代乙醛缩乙二醇三苯基膦盐加入二氯甲烷中，搅拌后加入NaOH溶液，继续搅拌后加入浓盐酸，继续搅拌，然后将反应体系倒入水中，萃取干燥后浓缩纯化得到化合物Ⅰ；(2)将化合物Ⅰ、2
‑
甲基吡啶盐、哌啶溶于醇性溶剂，加热回流至结束，旋转蒸发除去溶剂，纯化，得式Ⅰ所示荧光分子探针。3.如权利要求2所述的可特异性识别细胞色素氧化酶CYP3A4的近红外荧光分子探针的制备，其特征在于：所述步骤(1)中色酮
‑3‑
甲醛、溴代乙醛缩乙二醇三苯基膦盐加入二氯甲烷后的搅拌时间为30min，加入NaOH溶液后的搅拌时间为3h，加入浓盐酸后的搅拌时间为30min。4.如权利要求2所述的可特异性识别细胞色素氧化酶CYP3A4的近红外荧光分子探针的制备，其特征在于：所述步骤(1)中色酮
‑3‑
甲醛与溴代乙醛缩乙二醇三苯基膦盐的摩尔比为1:1.1～1:1.5，色酮
‑3‑
甲醛与二氯甲烷的用量比为1:3～1:10mmol/mL，色酮
‑3‑

【专利技术属性】
技术研发人员：刘美慧，曾文彬，李石，刘祖源，
申请(专利权)人：湖南超亟检测技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：