基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法技术

本发明专利技术公开了基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法；本发明专利技术通过将抗体

【技术实现步骤摘要】
基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法


[0001]本专利技术属于生物检测方法
，尤其涉及基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法。

技术介绍

[0002]荧光免疫分析(FIA)有更高的灵敏度和检测范围，在临床诊断、食品质量和环境监测等领域有广泛的应用价值【Chemical Engineering Journal2019, 361, 499
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507.】。相比较传统酶免疫分析技术(EIA)，FIA可以实现特定蛋白质、小分子毒素和病毒的痕量检测【Immunological Investigations 1987,16, 227
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240.】。
[0003]如今，为了获得更高的灵敏度和检测限，荧光标记材料不仅要求有较高的荧光效率，而且具有较大的斯托克斯位移以减少串扰。目前，各种荧光标记物广泛应用于荧光免疫分析平台，包括有机染料、量子点、上转化、钙钛矿纳米晶体，使得荧光免疫分析比传统的酶免疫分析技术具有更低的检出限和更高的灵敏度。然而，荧光材料在荧光免疫分析平台上也有一些不可避免的局限性:光稳定性差、细胞毒性高、量子产率低【Nat Med 2014, 20 (8), 948
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53】。因此，人们做了大量的工作精力来制造明亮的荧光信号，包括将单个分子转化为数亿个荧光聚合体。将荧光分子填充到微载体中获得明亮的荧光是一项巨大的挑战，因为在局部浓度较高时，荧光团聚集会引起自猝灭，从而导致荧光强度下降【Biosens Bioelectron 2016, 85, 317
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323.】。
[0004]唐本忠课题组在2001年首次报道了一种具有独特聚集诱导发射(AIE)特性的新型荧光发光体【Chem. Commun, 2001, 1740.】。AIEgens在聚集态有很强的荧光发射，但在分子溶解状态时不发射荧光，这与聚集诱导猝灭(ACQ)现象相反。具有聚集诱导发射(AIE)特性的荧光材料可能有助于解决上述问题，AIE特性具有高亮度、抗光漂白能力强和良好的生物相容性，特别适合开发新型化学传感器和生物传感器【Biosens Bioelectron 2020,150, 111912.】。直到最近，李万万小组开发了AIEgens荧光免疫测定法，然而AIE分子是疏水的，必须要通过复杂的分子设计和合成来适应荧光免疫分析平台【Biosens. Bioelectron. 2019,135.】。因此，开发一种直接产生高荧光信号的AIEgens传感器是十分必要的。

技术实现思路

[0005]为解决现有技术存在的不足，本专利技术旨在提供基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法。
[0006]本专利技术以羧酸修饰的聚集诱导发光（AIE）分子填充的发光微球为信号输出基元，利用其大的斯托克斯位移、良好水分散性、抗磁猝灭荧光能力和优异的光漂白性等特点，采用识别抗体修饰后再与相应抗体修饰的磁性微球载体复合，利用双抗夹心法或竞争法实现对标志物的选择性识别，进而通过对发光信号强度的测量与标志物形成对应关系，得到一类AIE生物传感器的系统方法。进一步调节发光微球的制备工艺、偶联方式及纯化方法、荧光微球和磁性微球的粒径比等因素，实现对其灵敏度和测试范围的调节；其中，以CRP检测
为例，在单次不稀释样本的前提下，检测限可以达到0.5ng/mL，并实现1
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1000ng/mL的超长程检测，为即时快速检测提供新的策略。
[0007]本专利技术设计了一种新型的磁性
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AIE荧光免疫生物传感方法，可直接应用于现有的荧光免疫分析平台上，实现高灵敏度且长程的快速检测。通过溶胀挥发法将数千个AIE分子嵌入到纳米级微球基质中，使AIE纳米粒子具有水分散性、大的stokes位移和高的量子产率。结合磁珠富集和快速分离，利用磁性
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AIE生物传感器检测多种标志物；例如常见标志物 C反应蛋白（CRP），实现抗原的高灵敏度和大的线性范围检测。
[0008]本专利技术采用的技术方案是：基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法，包括以下步骤：抗体
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1标记的聚集诱导发光微球溶液和抗体
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2标记的磁性微球溶液混合，再加入含抗原的待测溶液，测定荧光信号值，根据标准曲线得到待测溶液中抗原的浓度。
[0009]优选地，所述的检测方法用于非疾病诊断领域；如食品质量检测和环境监测等。
[0010]本专利技术采用三明治夹心结构测试聚集诱导发光微球的荧光免疫的效果。抗体
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2标记磁性作为化学分离载体，抗体
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1标记的聚集诱导发光微球作为荧光输出单元；在96孔板中加入抗体
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1标记聚集诱导发光微球和抗体
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2标记磁性微球，再加入稀释后的样本，使用酶标仪测定荧光信号值。
[0011]优选地，所述抗体
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1和抗体
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2可以与抗原特异性结合；所述抗体
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1和抗体
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2可以相同或不同；所述荧光信号值使用酶标仪测定。
[0012]优选地，所述抗体
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1标记的聚集诱导发光微球和抗体
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2标记的磁性微球的粒径比为0.3以下；所述抗体
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1标记的聚集诱导发光微球的粒径为200 nm及以下。
[0013]进一步优选地，所述抗体
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1标记的聚集诱导发光微球和抗体
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2标记的磁性微球的粒径比为0.2；所述抗体
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1标记的聚集诱导发光微球的粒径为188 nm。
[0014]优选地，所述抗体
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1标记的聚集诱导发光微球的制备方法包括以下步骤：（1）将羧基修饰的纳米级微球基质、乳化剂（水溶性乳化剂）分散于水中，得到水相溶液，（2）将AIE分子溶解于有机溶剂中，得到油相溶液；（3）将步骤（2）的油相溶液加入到步骤（1）所述的水相溶液，升高温度，封闭溶胀后，挥发溶剂，制得AIE荧光微球乳液；离心，分散在水中，得到聚集诱导发光微球；（4）将步骤（3）制得的聚集诱导发光微球加入酸性缓冲液，超声分散后加入碳二亚胺缩合试剂，放入混合仪活化羧基，离心去上清，得活化后的聚集诱导发光微球；（5）将步骤（4）活化后的聚集诱导发光微球，加入碱性缓冲液和抗体
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1，放入混合仪孵育，离心取上清，加入封闭液和保存液，超声分散，得到抗体
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1标记的聚集诱导发光微球。
[0015]进一步优选地，步骤（1）中，所述羧基修饰的纳米级微球基质的质量用量为水质量用量的0.01%~20%。
[0016]进一步优选地，步骤（1）中，所述的羧基修饰的纳米级微球基质的粒径为50 nm~500 nm。微球基质是本领域所知悉的纳米级微球基质。更优选的粒径为200 nm~400 nm。
[0017]进一步优选地，步骤（1）中，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：抗体
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1标记的聚集诱导发光微球溶液和抗体
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2标记的磁性微球溶液混合，再加入含抗原的待测溶液，测定荧光信号值，根据标准曲线得到待测溶液中抗原的浓度。2.根据权利要求1所述的基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法，其特征在于，所述抗体
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1和抗体
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2可以与抗原特异性结合；所述抗体
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1和抗体
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2可以相同或不同；所述荧光信号值使用酶标仪测定；所述的检测方法用于非疾病诊断领域。3.根据权利要求1所述的基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法，其特征在于，所述抗体
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1标记的聚集诱导发光微球和抗体
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2标记的磁性微球的粒径比为0.3以下；所述抗体
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1标记的聚集诱导发光微球的粒径为200 nm及以下。4.根据权利要求1所述的基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法，其特征在于，所述抗体
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1标记的聚集诱导发光微球的制备方法包括以下步骤：（1）将羧基修饰的纳米级微球基质、乳化剂分散于水中，得到水相溶液，（2）将AIE分子溶解于有机溶剂中，得到油相溶液；（3）将步骤（2）的油相溶液加入到步骤（1）所述的水相溶液，升高温度，封闭溶胀后，挥发溶剂，制得AIE荧光微球乳液；离心，分散在水中，得到聚集诱导发光微球；（4）将步骤（3）制得的聚集诱导发光微球加入酸性缓冲液，超声分散后加入碳二亚胺缩合试剂，放入混合仪活化羧基，离心去上清，得活化后的聚集诱导发光微球；（5）将步骤（4）活化后的聚集诱导发光微球，加入碱性缓冲液和抗体
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1，放入混合仪孵育，离心取上清，加入封闭液和保存液，超声分散，得到抗体
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1标记的聚集诱导发光微球。5.根据权利要求4所述的基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述羧基修饰的纳米级微球基质的质量用量为水质量用量的0.01%~20%；所述的羧基修饰的纳米级微球基质的粒径为50 nm~500 nm；所述乳化剂的质量用量为水质量用量的0.01%~10%；所述乳化剂选自下列至少一种：MOA
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50、O
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50、十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇、吐温20、十二烷基苯磺酸钠。6.根据权利要求4所述的基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法，其特征在于，步骤（2）中，所述AIE分子质量用量为有机溶剂质量的0.05%~20%；所述有机溶剂的质量用量为步骤（1）水质量的0.5%~50%；所述有机溶剂选自下列一种或者两种混合：二氯甲烷、四氢呋喃、氯仿、苯甲醇、苯甲醚、甲苯；所述的AIE分子选自下列AIE
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1至AIE
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16分子中的至少一种：
7.根据权利要求4所述的基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法，其特征在于，步骤（3）中，所述温度为20 ℃~70 ℃，所述封闭溶胀的时间为1 h~5 h；所述挥发溶剂的时间为5 h~24 h；所述离心转速为8000 rpm~12000 rpm；所述离心的次数为三次以
上；步骤（4）中，所述酸性缓冲液为甘氨酸
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盐酸缓冲液、邻苯二甲酸
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盐酸缓冲液、磷酸氢二钠
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柠檬酸缓冲液或2...

【专利技术属性】
技术研发人员：王志明，唐本忠，胡亚新，付海海，谢莉，刘勇，程松，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：