白蛋白结合型紫杉醇纳米粒的检测方法技术

本发明专利技术涉及白蛋白结合型紫杉醇纳米粒的检测方法，属于质量控制技术领域。本发明专利技术提供了白蛋白结合型紫杉醇纳米粒的检测方法，包括如下步骤：配制供试品溶液、配制透析介质、透析、检测紫杉醇浓度和检测荧光强度。该方法主要采用透析的方式，通过优化供试品溶液浓度、透析介质浓度、透析时间和检测荧光强度的温度条件，能够准确检测纳米粒的荧光淬灭类型，以及其中紫杉醇与白蛋白的结合位点数、结合常数、作用力类型。本发明专利技术检测方法所用仪器设备不复杂，操作简单快速，特异性强，重现性好，所需样品量少，数据拟合线性良好，能够快速准确地判断白蛋白与紫杉醇的结合属性，具有广阔的推广应用前景。推广应用前景。推广应用前景。

【技术实现步骤摘要】
白蛋白结合型紫杉醇纳米粒的检测方法


[0001]本专利技术涉及白蛋白结合型紫杉醇纳米粒的检测方法，属于质量控制


技术介绍

[0002]注射用紫杉醇(白蛋白结合型)为紫杉醇与人血白蛋白经纳米技术制成的注射用冻干粉针剂。将紫杉醇与人血白蛋白结合，优势在于能够提高疗效，同时减轻毒性。其中，白蛋白与紫杉醇之间相互作用的属性，包括荧光淬灭类型，紫杉醇与白蛋白的结合位点数、结合常数、作用力类型，对于工艺的控制以及产品质量属性的表征有着较重要意义。因此，有必要开发一种高效的检测方法用以检测白蛋白结合型紫杉醇纳米粒中白蛋白与紫杉醇相互作用的属性。

技术实现思路

[0003]本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的目的在于提供白蛋白结合型紫杉醇纳米粒的检测方法，特别是检测其中白蛋白与紫杉醇相互作用属性(包括荧光淬灭类型，紫杉醇与白蛋白的结合位点数、结合常数、作用力类型)的方法。
[0004]本专利技术提供了白蛋白结合型紫杉醇纳米粒的检测方法，包括如下步骤：
[0005]配制供试品溶液：取白蛋白结合型紫杉醇纳米粒或含有其的待测样品，加入氯化钠水溶液至白蛋白浓度为0.7～1.1mg/ml，紫杉醇浓度为0.095～0.108mg/ml，分散均匀，备用；
[0006]配制透析介质：取白蛋白，加入氯化钠水溶液至白蛋白浓度为0.08～0.12％，g/ml，分散均匀，备用；
[0007]透析：取供试品溶液在透析介质中进行透析，于透析15～90min以内取出4～5份保留液，相邻保留液取出时间间隔在15min以上，备用；
[0008]检测紫杉醇浓度：供试品溶液以及取出的4～5份保留液，分别检测其中紫杉醇的浓度；
[0009]检测荧光强度：供试品溶液以及取出的4～5份保留液，在28℃和37
±
3℃条件下分别检测荧光强度。
[0010]上述检测方法中，通过透析使供试品溶液中一部分紫杉醇游离到透析介质中，从而使供试品溶液的紫杉醇浓度发生变化，而供试品溶液的白蛋白浓度不变；进一步通过控制透析时间营造出不同浓度紫杉醇与相同浓度白蛋白结合的模型，通过检测白蛋白的内源荧光在两个不同温度下的的淬灭情况来判断荧光淬灭类型，定量计算紫杉醇与白蛋白的结合位点数、结合常数及判断紫杉醇与白蛋白之间结合的作用力类型。
[0011]上述检测方法是基于专利技术人的下列发现而获得的：
[0012]经实验考察，供试品溶液中白蛋白浓度为0.7～1.1mg/ml，紫杉醇浓度为0.095～0.108mg/ml时能够保证检测结果的准确性。供试品溶液浓度过低或过高时，白蛋白荧光强度的变化仪器均无法准确检测。
[0013]透析介质中白蛋白浓度为0.08～0.12％，g/ml时才能准确取样。若透析介质浓度过低，紫杉醇会在透析介质中析出，导致透析袋外紫杉醇浓度低，从而加速紫杉醇从透析袋内到透析袋外的过程，使得取样难度增大。
[0014]于透析15～90min以内取出4～5份保留液，相邻保留液取出时间间隔在15min以上，由此能够获得准确的检测结果。若透析时间过长，透析袋内紫杉醇浓度过低，白蛋白内源荧光淬灭程度小，将导致荧光强度的变化值仪器无法准确检测；若透析取样时间点间隔短，紫杉醇分子透出少，透析袋内紫杉醇浓度变化小，白蛋白荧光强度的变化仪器同样无法准确检测，将导致线性拟合效果差。
[0015]在28℃和37
±
3℃条件下分别检测荧光强度能够保证检测结果的准确性。荧光强度检测的温度会影响荧光强度，温度越高，荧光强度越低，当温度过高时，荧光强度过低，仪器误差对实验结果影响较大；温度过低时，一方面在室温条件下难以进行检测，二方面检测结果同样会不准确。
[0016]进一步地，配制供试品溶液步骤中，加入氯化钠水溶液至白蛋白浓度为0.8～0.9mg/ml，紫杉醇浓度为0.100mg/ml。
[0017]进一步地，配制透析介质步骤中，加入氯化钠水溶液至白蛋白浓度为0.1％，g/ml。
[0018]进一步地，配制供试品溶液、配制透析介质步骤中，所述氯化钠水溶液的浓度为0.8～1.0％，g/ml。
[0019]优选地，配制供试品溶液、配制透析介质步骤中，所述氯化钠水溶液的浓度为0.9％，g/ml。
[0020]进一步地，透析步骤中，分别于透析15min、30min、45min、60min四个时间点取出保留液。
[0021]进一步地，透析步骤中，将所述供试品溶液置于透析袋中透析。此时，保留液是指保留在透析袋内未透析出的样品溶液。
[0022]进一步地，在透析之前对所述透析介质作如下预处理：将装有透析介质的容器置于37℃，转速为150转/min的恒温培养摇床中，预热30min。
[0023]进一步地，检测荧光强度步骤中，在28℃和37℃条件下分别检测荧光强度。
[0024]进一步地，检测荧光强度的激发波长为280nm；检测348nm波长处的荧光强度。
[0025]进一步地，所述白蛋白为人血白蛋白。
[0026]进一步地，采用液相色谱法检测紫杉醇浓度。
[0027]优选地，色谱柱为Fluorosep
‑
RP Phenyl 5μ 60A 250*4.0mm。
[0028]优选地，流动相为乙腈：水体积比为9：11的混合溶剂。
[0029]优选地，检测波长为227nm。
[0030]进一步地，所述的检测方法还包括如下步骤：根据紫杉醇浓度和荧光强度检测结果制作Stem
‑
Volmer曲线，得到淬灭常数、扩散常数中至少一项。具体地，根据方程式将白蛋白溶液的荧光强度记为F0，F为各时间点荧光样品的荧光强度，C
Q
为各时间点紫杉醇的浓度，以F0/F对紫杉醇浓度的关系作图。K
sv
表示淬灭常数，K
q
表示扩散常数。
[0031]进一步地，所述的检测方法还包括如下步骤：根据紫杉醇浓度和荧光强度检测结果制作双对数曲线，得到结合位点数、结合常数、ΔG、ΔH、ΔS中至少一项。具体地，根据方程式lg[(F0‑
F)/F]＝lgK+nlg[D]，将白蛋白溶液的荧光强度记为F0，F为各时间点荧光样品的荧光强度，D为各时间点紫杉醇的浓度，以lg((F0‑
F)/F)对lg(D)作图。n表示紫杉醇与白蛋白的结合位点数，K表示结合常数，根据结合常数K进一步计算得到紫杉醇与白蛋白相互作用的热力学参数ΔG、ΔH、ΔS。
[0032]本专利技术提供了白蛋白结合型紫杉醇纳米粒的检测方法，主要采用透析的方式，通过优化供试品溶液浓度、透析介质浓度、透析时间和检测荧光强度的温度条件，能够准确检测纳米粒的荧光淬灭类型，以及其中紫杉醇与白蛋白的结合位点数、结合常数、作用力类型。本专利技术检测方法所用仪器设备不复杂，操作简单快速，特异性强，重现性好，所需样品量少，数据拟合线性良好，能够快速准确地判断白蛋白与紫杉醇的结本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.白蛋白结合型紫杉醇纳米粒的检测方法，其特征是：包括如下步骤：配制供试品溶液：取白蛋白结合型紫杉醇纳米粒或含有其的待测样品，加入氯化钠水溶液至白蛋白浓度为0.7～1.1mg/ml，紫杉醇浓度为0.095～0.108mg/ml，分散均匀，备用；配制透析介质：取白蛋白，加入氯化钠水溶液至白蛋白浓度为0.08～0.12％，g/ml，分散均匀，备用；透析：取供试品溶液在透析介质中进行透析，于透析15～90min以内取出4～5份保留液，相邻保留液取出时间间隔在15min以上，备用；检测紫杉醇浓度：供试品溶液以及取出的4～5份保留液，分别检测其中紫杉醇的浓度；检测荧光强度：供试品溶液以及取出的4～5份保留液，在28℃和37
±
3℃条件下分别检测荧光强度。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征是：配制供试品溶液步骤中，加入氯化钠水溶液至白蛋白浓度为0.8～0.9mg/ml，紫杉醇浓度为0.100mg/ml。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征是：配制透析介质步骤中，加入氯化钠水溶液至白蛋白浓度为0.1％，g/ml。4.根据权利要求1～3任意一项所述的检测方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：何玲，张晋，熊文，杨艳艳，詹晓勇，葛祥军，胡和平，
申请(专利权)人：四川汇宇海玥医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：