一种三维结构光照明超分辨显微成像的高保真重构的方法和装置制造方法及图纸

一种三维结构光照明超分辨显微成像的高保真重构的方法，包括：将一束平行光分为强度相等、偏振方向一致的三束平行光束，在样品上进行干涉形成三维非均匀照明光场，样品受到非均匀照明光场调制后频谱产生频移；由物镜接收样品发出的荧光信号后，经过场镜汇聚到成像像面，用探测器接收该荧光信号，得到一张混有样品高低频信息的低分辨率图像；多次改变照明光场的空间位移和方向，再次拍摄受光场调制的荧光信号，得到一系列混有样品高低频信息的低分辨率图像，作为原始图像。再将原始图像进行后续图像处理，首先进行照明光场的初始相位和空间频率的参数估计，然后再对样品各个频带进行分离，最后将各频谱进行组合重构出样品的高保真超分辨图像。真超分辨图像。真超分辨图像。

【技术实现步骤摘要】
一种三维结构光照明超分辨显微成像的高保真重构的方法和装置


[0001]本专利技术涉及光学超分辨显微成像领域，具体地说，涉及一种三维结构光照明超分辨显微成像的高保真重构的方法和装置。

技术介绍

[0002]学显微镜具有光损伤小、特异性强、速度快、视场大以及可进行三维成像等优点，是现有显微技术中唯一有可能对活细胞进行三维快速成像的技术。但由于光学衍射极限的存在，常规光学显微成像的横向分辨率一般被限制在半波长量级，轴向分辨率则更低，只能达到横向分辨率的三分之一左右，无法满足细胞内亚百纳米尺度下活细胞器观测的需求。在过去的二三十年间，各种超分辨成像技术相继提出，包括受激辐射损耗显微术(STED)、随机光重构显微术(PALM/STORM)和结构光照明超分辨显微成像技术(SIM)，这些技术的提出为生命科学的发展起到了极大的促进作用。
[0003]在众多超分辨显微成像方法中，SIM具有进行活细胞成像的诸多天然优势：例如，相比于STED通过高功率损耗光(约GW/cm2)实现超分辨，SIM对激发光强的要求较低(在10W/cm2量级)，因此具有低光漂白和光损伤的本征优势；也无需像单分子定位显微术(SMLM)那样需获取数以千帧原始图像以重构一幅超分辨图像，SIM仅需9帧(2D
‑
SIM)或15帧(3D
‑
SIM单层)图用于重构一幅超分辨图像，因而具有快速成像的本征优点，特别适用于生物活细胞成像。
[0004]但是由于SIM超分辨图像的获得还依赖于后续复杂的图像重构过程。在成像过程中，SIM是通过结构光照明到样品上对样品进行调制，通过莫尔条纹效应，将系统原本无法探测的样品高频信息调制到低通带内，进而提高了分辨率。但是由于探测的图像是各个频带的混叠，为了将各个频带分量进行准确分离，需要对照明光场的调制度a
m
，空间频率k
xy
，以及相位进行准确估计。调制度a
m
的值影响高频分量在整个重构频谱的比值，最终仅影响图像的对比度，因此影响相对较小；空间频率p可以通过频谱分量对比等方法求得，估计的精度可以满足需求；而在求解各个频带分量时，需要知道精确的相位值，否则各个频谱在分离时无法完全实现，各个频带将含有其他频带的频谱分量，这些频谱残差在后续进行频移移回自己的位置时将出现错误，进而导致伪像的出现。传统的方法在进行相位估计时通过频谱峰值位置求取或者通过自相关的方式，存在估计误差，特别是在图像含有噪声时，相位估计将出现错误，从而影响最终图像重构的质量。

技术实现思路

[0005]本专利技术要克服现有技术的不足，提供一种三维结构光照明超分辨显微成像的高保真重构的方法和装置。
[0006]本专利技术针对以上问题，提出一种涉及在图像重构过程中新的相位估计方法，通过构造一个中间函数，相比于传统的相位估计方法，该方法可以精确估计照明光场进行五步
移相时对应的初始相位；此外利用该方法还可以消除在计算相位过程中由于噪声的影响导致的相位估计不准确带来的影响。利用本专利技术提出的精确相位计算方法，可以实现对各个频带分量进行准确分离，消除了因相位估计不准确导致的重构伪像的影响，最终获得样品的高保真重构。
[0007]本专利技术的一种三维结构光照明超分辨显微成像的高保真重构的方法，包括以下步骤：
[0008](1)将一束平行光分为强度相等、偏振方向一致的三束平行光束，汇聚到物镜的入瞳面，再经过物镜后变成三束平行光，三束光在样品上进行干涉形成横向和轴向都包含周期结构的照明光场照明荧光样品，荧光样品收到非均匀照明光场调制后频谱产生频移；由物镜接收荧光样品发出的荧光信号后，经过场镜汇聚到成像像面，用探测器接收该荧光信号，得到一张混有荧光样品高低频信息的低分辨率图像；
[0009](2)多次改变照明光场的空间位移和方向，再次拍摄受条纹强度调制的荧光信号，直至拍摄完一层样品对应图像；然后再改变样品轴向位置，重复拍摄不同照明光场空间位置和方向照明下的样品荧光信号，得到一系列混有荧光样品高低频信息的三维低分辨率图像，作为原始图像；
[0010](3)将步骤(2)获得的原始图像进行后续图像处理，首先进行参数估计，包括照明光场的空间频率p，以及相位其次对荧光样品的各个频带进行分离；最后将各个频谱进行组合重构出样品的高保真超分辨图像。
[0011]进一步地，所述步骤(1)中采用的物镜为数值孔径NA大于1.33的油浸型物镜。
[0012]进一步地，所述步骤(1)中，三束光中，其中一束汇聚到物镜入瞳中心位置，再经过物镜后垂直入射到样品上，另两束平行光束汇聚到该物镜的入射光瞳边缘处，两聚焦点所连直线经过入瞳圆心，两聚焦点的距离接近入瞳直径以尽量充分利用物镜数值孔径，经过物镜的两束聚焦光出射后以超过临界角的角度入射到荧光样品，三束光最后在样品上干涉形成非均匀照明光场照明样品。
[0013]进一步地，所述步骤(2)产生原始图像的步骤如下：
[0014](2.1)每个方向下的照明光场通过改变中心光路的光程，并同时改变边缘光束中其中一路光的光程，使后者光程为前者光程的两倍，使照明光场在横向上每次移动其周期的五分之一，而轴向光场相对于物镜不动，实现照明的五步移相，如图2所示；
[0015](2.2)依次改变两束边缘光会聚在物镜入瞳处两聚焦光点的位置，从而干涉形成横向方向上对应的照明光场，直到在一个π方位角内均匀产生3个方向的照明光场，为横向方向提供二向同性的分辨率提升；
[0016](2.3)每次在改变照明光场的空间位移或方向，以及样品的轴向位置时，荧光样品被调制后发出混频信号被探测器接收，形成一张低分辨率图，共形成15*n(n为样品层数)张原始图像作为后续图像重构的原始图；
[0017]进一步地，所述步骤(3)中，后续的图像处理过程包括如下步骤：
[0018](3.1)首先进行参数估计，包括照明光场的空间频率k
xy
，以及相位作为后续重构过程中恢复一张高质量超分辨图像的前提，具体包括以下子步骤：
[0019]a.建立某个方向照明光场五步相移照明时的成像模型：
[0020]D(r)＝[S(r)
·
I(r)]*H(r)+D
b
(r)，
ꢀꢀ
(1)其中，D(r)为3D
‑
SIM拍摄的原始图像，H
(r)为系统的三维PSF，S(r)为样品的分布函数，为照明光场，k
xy
是照明光场的横向调制频率，r是空间坐标，是照明光场的相位，D
b
(r)为背景噪声，当照明光场轴向相对于物镜不动，则公式(1)可以改写为以下形式：
[0021][0022]b.将上式变换到傅里叶空间，第n个相移时获得拍摄的原始图像对应的傅里叶频谱：
[0023][0024]式中，是每个横向分量m对应的OTF，k是傅里叶空间上的坐标。由上式可知，所获得的原始图像的频谱为各个频带的混叠；
[0025]c.将五本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种三维结构光照明超分辨显微成像的高保真重构的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将一束平行光分为强度相等、偏振方向一致的三束平行光束，汇聚到物镜的入瞳面，再经过物镜后变成三束平行光，三束光在样品上进行干涉形成横向和轴向都包含周期结构的照明光场照明荧光样品，荧光样品受到非均匀照明光场调制后频谱产生频移；由物镜接收荧光样品发出的荧光信号后，经过场镜汇聚到成像像面，用探测器接收该荧光信号，得到一张混有荧光样品高低频信息的低分辨率图像；(2)多次改变照明光场的空间位移和方向，再次拍摄受条纹强度调制的荧光信号，直至拍摄完一层样品对应图像；然后再改变样品轴向位置，重复拍摄不同照明光场空间位置和方向照明下的样品荧光信号，得到一系列混有荧光样品高低频信息的三维低分辨率图像，作为原始图像；(3)将步骤(2)获得的原始图像进行后续图像处理，首先进行参数估计，包括照明光场的空间频率p，以及相位其次对荧光样品的各个频带进行分离；最后将各个频谱进行组合重构出样品的高保真超分辨图像。2.根据权利要求1所述的一种三维结构光照明超分辨显微成像的高保真重构的方法，其特征在于，所述步骤(1)中采用的物镜为数值孔径NA大于1.33的油浸型物镜。3.根据权利要求1所述的一种三维结构光照明超分辨显微成像的高保真重构的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，三束光中，其中一束汇聚到物镜入瞳中心位置，再经过物镜后垂直入射到样品上，另两束平行光束汇聚到该物镜的入射光瞳边缘处，两聚焦点所连直线经过入瞳圆心，两聚焦点的距离接近入瞳直径以尽量充分利用物镜数值孔径，经过物镜的两束聚焦光出射后以超过临界角的角度入射到荧光样品，三束光最后在样品上干涉形成非均匀照明光场照明样品。4.根据权利要求1所述的一种三维结构光照明超分辨显微成像的高保真重构的方法，其特征在于，所述步骤(2)产生原始图像的步骤如下：(2.1)每个方向下的照明光场通过改变中心光路的光程，并同时改变边缘光束中其中一路光的光程，使后者光程为前者光程的两倍，使照明光场在横向上每次移动其周期的五分之一，而轴向光场相对于物镜不动，实现照明的五步移相；(2.2)依次改变两束边缘光会聚在物镜入瞳处两聚焦光点的位置，从而干涉形成横向方向上对应的照明光场，直到在一个π方位角内均匀产生3个方向的照明光场，为横向方向提供二向同性的分辨率提升；(2.3)每次在改变照明光场的空间位移或方向时，荧光样品被调制后发出混频信号被探测器接收，形成一张低分辨率图；(2.4)当对样品拍摄完一层后，移动样品至下一层，重复步骤(2.1)
‑
(2.3)，拍摄不同层样品对应的低分辨率图。5.根据权利要求4所述的一种三维结构光照明超分辨显微成像的高保真重构的方法，其特征在于，所述步骤(2.4)中，共形成15*n(n为样品层数)张原始图像作为后续图像重构的原始图。6.根据权利要求1所述的一种三维结构光照明超分辨显微成像的高保真重构的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，后续的图像处理过程包括：
(3.1)首先进行参数估计，包括照明光场的空间频率k
xy
，以及相位作为后续重构过程中恢复一张高质量超分辨图像的前提；(3.2)利用步骤(3.1)所估计的参数进行后续的图像重构。7.根据权利要求6所述的一种三维结构光照明超分辨显微成像的高保真重构的方法，其特征在于，步骤(3.1)所述的参数估计，具体包括：a.建立某个方向照明光场五步相移照明时的成像模型：D(r)＝[S(r)
·
I(r)]*H(r)+D
b
(r) ，
ꢀꢀꢀ
(1)其中，D(r)为3D
‑
SIM拍摄的原始图像，H(r)为系统的三维PSF，S(r)为样品的分布函数，为照明光场，k
xy
是照明光场的横向调制频率，r是空间坐标，是照明光场的相位，D
b
(r)为背景噪声，当照明光场轴向相对于物镜不动，则公式(1)可以改写为以下形式：b.将上式变换到傅里叶空间，第n个相移时获得拍摄的原始图像对应的傅里叶频谱：式中，是每个横向分量m对应的OTF，k是傅里叶空间上的坐标。由上式可知，所获得的原始图像的频谱为各个频带的混叠；c.将五步移相获得的原始图像频谱表示成矩阵形式：其中，向量和分别定义为以及而向量中的元素为并且矩阵M中的元素M
nm
为d.对公式(3)表示的原始图像频谱做自相关，可求得照明光场的横向调制频率k
xy
：：表示相关，上标*表示复共轭，将在k
′
＝mk
xy
处获得强度极大值，找到其对应坐标即可求得mk
xy
...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡翠方，刘秋兰，徐良，朱大钊，张智敏，刘旭，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：