一种产生紧密连接结构的贴壁细胞的培养方法技术

本发明专利技术提供一种产生紧密连接结构的贴壁细胞的培养方法，包括：将经培养基重悬的贴壁细胞接种于培养容器内的底部支撑液体上进行培养，得膜状细胞片；所述底部支撑液体的密度大于培养基的密度，且不与培养基互溶。本发明专利技术的培养方法首次将底部支撑液体应用于贴壁细胞的培养，能够促进贴壁细胞之间形成紧密连接并分泌大量细胞外基质形成高细胞密度的膜状细胞片，很好地模拟了体内组织结构；同时可以免去传统贴壁细胞培养方法中磷酸缓冲液清洗以及胰酶消化步骤，保留了贴壁细胞在生长过程中的细胞外基质，更好地还原了细胞生长微环境，使其更加适合在生命科学和临床医学研究；且该培养方法简便易操作，并且额外成本低，具有巨大的商业价值。有巨大的商业价值。

【技术实现步骤摘要】
一种产生紧密连接结构的贴壁细胞的培养方法


[0001]本专利技术属于生物医学工程下属的组织工程和生物制造
，具体涉及一种产生紧密连接结构的贴壁细胞的培养方法。

技术介绍

[0002]细胞体外维持和生长技术的建立是生物科学的一个重要里程碑。体外细胞培养是指在体外获得原本生长在体内的细胞，为其提供必要的物理化学线索和生长因子，以维持其基本生命过程的过程。细胞培养是生命科学和临床医学研究的重要组成部分。它可以在体外方便地再现人体的基本生命过程，帮助我们研究人体组织或器官在体外的形成和功能，为研究病理生理过程、疾病发生和药物开发提供方便和替代的途径。
[0003]为了方便、高通量地再现细胞的生命过程，基于固体基质的细胞培养已经成为最广泛和常用的细胞培养方法。固体基质细胞培养方法简单、成本低、鲁棒性高，自1912年引入以来没有发生过重大变化。
[0004]然而，传统的固体基质细胞培养方法无法重建体内细胞微环境，导致细胞表型和基因型发生变化，影响生命科学和临床医学研究的可靠性和可重复性。一些先进的固体基质细胞培养方法采用类似于细胞外基质的水凝胶作为支架进行细胞培养，可以为细胞提供合适的三维微环境。然而，使用三维固体基质培养细胞很难保证可媲美人体组织的高细胞密度。此外，三维固体基质细胞培养方法的经验依赖性和高成本的特点也限制了其广泛应用。利用磁场、声场或机械力将单分散细胞组装成细胞微球，可构建与人体组织相当的高细胞密度和紧密连接。然而，外力介导的固体基质细胞培养方法由于操作复杂、学习门槛高而未能得到广泛应用。
[0005]因此，提供一种易于使用的、能够促进贴壁细胞之间形成紧密连接并分泌大量细胞外基质形成高细胞密度的细胞培养方式显得很有必要。

技术实现思路

[0006]为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种产生紧密连接结构的贴壁细胞的培养方法，该培养方法具有简便易操作，额外成本低的特点，并能够促进贴壁细胞之间形成紧密连接并分泌大量细胞外基质形成高细胞密度的膜状细胞片。
[0007]本专利技术提供的产生紧密连接结构的贴壁细胞的培养方法突破了传统细胞培养方法无法兼顾简便易操作，额外成本低以及很好地重建体内细胞微环境的限制，具有巨大的商业价值。
[0008]一种产生紧密连接结构的贴壁细胞的培养方法，包括：将经培养基重悬的贴壁细胞接种于培养容器内的底部支撑液体上，并在底部支撑液体表面完成培养；
[0009]所述底部支撑液体的密度大于培养基的密度，且不与培养基互溶。
[0010]上述贴壁细胞为细胞培养时贴壁生长的细胞。采用上述培养方法即可以应用于正常贴壁细胞的培养，也可以应用于高细胞密度的膜状细胞片的培养。当该培养方法应用于
形成膜状细胞片时，得到的膜状细胞片可应用于3D生物打印、细胞补片及药物测试中。
[0011]作为优选，所述底部支撑液体包括但不限于氟化油、氟代烷烃类化合物、硅氧烷类化合物(如硅油、未固化的聚二甲基硅氧烷)、酯类化合物(如碳酸二甲酯、硫酸二甲酯)中的一种或多种的混合物。
[0012]作为进一步优选，所述底部支撑液体为3M Novec HFE系列氟化油(如HFE7500)、3M Fluorinert FC系列氟化油、TECCEM Fluoronox系列氟化油、硅油、未固化的聚二甲基硅氧烷、碳酸二甲酯、硫酸二甲酯中的一种或多种的混合物。
[0013]作为优选，培养容器内，所述底部支撑液体的添加量大于0.08mL/cm2。作为进一步优选，所述底部支撑液体的添加量为0.3～0.7mL/cm2。
[0014]作为优选，所述贴壁细胞的接种浓度为2
×
104～2
×
108个/cm2。进一步优选为1
×
106个/cm2～2
×
106个/cm2。
[0015]作为优选，贴壁细胞的培养温度为35～39℃，培养时间为1～28天。进一步优选为培养温度为37℃，培养时间为1～14天。
[0016]作为优选，贴壁细胞接种后在浓度为5％的二氧化碳培养箱中进行培养。
[0017]作为优选，贴壁细胞为复苏后的冻存细胞或传代消化后的细胞。
[0018]作为优选，贴壁细胞为干细胞、肿瘤细胞、上皮细胞、内皮细胞、胶质细胞、周细胞、成纤维细胞、神经细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞、胆管细胞、星状细胞、骨来源细胞、免疫相关细胞和其他各种组织或器官来源细胞中的一种或多种。
[0019]作为优选，培养期间每10～15h更换一次培养基，更换的培养基体积为原培养基体积的70～90％。作为进一步优选，培养期间每12h更换一次培养基。
[0020]作为进一步优选，更换培养基时，新的培养基经预热后再进行更换。
[0021]作为优选，所述底部支撑液体经灭菌后添加至培养容器内。
[0022]作为进一步优选，所述底部支撑液体采用化学试剂灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌、过滤除菌中的一种或多种灭菌方式进行灭菌。更进一步优选为紫外光灭菌。
[0023]培养容器可以是培养板、培养皿，也可以是适用于普通细胞培养的任何容器。培养容器也可为自定义材质、形状、结构的容器。作为优选，培养容器为商业化的多孔培养板。
[0024]作为具体优选，一种产生紧密连接结构的贴壁细胞的培养方法，包括如下步骤，
[0025]步骤一：将底部支撑液体灭菌后预先添加至贴壁细胞培养容器内；
[0026]步骤二：将贴壁细胞用培养基重悬并接种于底部支撑液体上；
[0027]步骤三：将接种后的贴壁细胞在35～39℃的温度下培养1～28天，培养期间，每10～15小时更换培养基。
[0028]本专利技术的产生紧密连接结构的贴壁细胞的培养方法应用于生命科学和临床医学研究中，可以实现贴壁细胞培养并促进贴壁细胞之间形成紧密连接并分泌大量细胞外基质形成膜状细胞片。
[0029]本专利技术的产生紧密连接结构的贴壁细胞的培养方法，首次将底部支撑液体应用于细胞培养，实现了更加多样化的细胞培养模式，扩展了现有的细胞培养方法的基底类型。
[0030]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0031](1)本专利技术的产生紧密连接结构的贴壁细胞的培养方法是对现有的细胞培养方法的一种补充方法，扩展了现有的细胞培养方法的基底类型，并且简便易操作，并且额外成本
低，具有巨大的商业价值。
[0032](2)本专利技术的产生紧密连接结构的贴壁细胞的培养方法，能够促进贴壁细胞之间形成紧密连接并分泌大量细胞外基质形成高细胞密度的膜状细胞片，很好地模拟了体内组织结构，使其更加适合在生命科学和临床医学研究，具有巨大的应用前景。
[0033](3)本专利技术的产生紧密连接结构的贴壁细胞的培养方法，可以免去传统贴壁细胞培养方法中磷酸缓冲液清洗以及胰酶消化步骤，保留了贴壁细胞在生长过程中的细胞外基质，更好地还原了细胞生长微环境，有利于生命科学和临床医学研究和应用。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产生紧密连接结构的贴壁细胞的培养方法，其特征在于，包括：将经培养基重悬的贴壁细胞接种于培养容器内的底部支撑液体上，并在底部支撑液体表面完成培养；所述底部支撑液体的密度大于培养基的密度，且不与培养基互溶。2.根据权利要求1所述的产生紧密连接结构的贴壁细胞的培养方法，其特征在于，培养容器内预先添加底部支撑液体，所述底部支撑液体为氟化油、氟代烷烃类化合物、硅氧烷类化合物、酯类化合物中的一种或多种的混合物。3.根据权利要求1所述的产生紧密连接结构的贴壁细胞的培养方法，其特征在于，培养容器内，所述底部支撑液体的添加量大于0.08mL/cm2。4.根据权利要求1所述的产生紧密...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺永，刘念，傅建中，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：