一种基于核酸恒温扩增的日本脑炎病毒检测试剂盒制造技术

本发明专利技术用于生物检测技术领域，具体为一种基于核酸恒温扩增的日本脑炎检测试剂盒。本发明专利技术检测试剂盒包括引物组、扩增反应试剂、阳性质控以及阴性对照；引物组根据NCBI中日本脑炎病毒基因组包膜蛋白E基因片段SEQ ID NO.5设计，为SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
一种基于核酸恒温扩增的日本脑炎病毒检测试剂盒


[0001]本专利技术用于生物检测
，具体涉及基于核酸恒温扩增的日本脑炎检测试剂盒。

技术介绍

[0002]日本脑炎病毒最早在日本发现，是一种人畜共患疾病，经由蚊子传播，主要分布在亚洲。其致死率高且后遗症严重，其诊断方法的研究十分具有意义。日本脑炎病毒的检测方法主要以基于血清的和分子诊断的方法为主。血清学检测方法主要包括传统血清学的补体结合试验、新型SPA协同凝集试验、免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、胶体金技术以及乳胶凝集试验等。分子诊断方法主要包括实时PCR方法、基因芯片技术以及核酸探针检测等技术。基于免疫的检测方法主要检测的是既往感染，无法实现即时检测和精准检测，容易漏诊。基于核酸的RT
‑
PCR方法可以通过特异性扩增RNA实现精准确诊，几乎没有窗口期，准确率高，但是其检测时间长，需要进行热循环。
[0003]环介导等温扩增是日本科学家在2000年左右专利技术的技术(Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop
‑
mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res.2000Jun 15；28(12):E63.)，通过识别模板序列200bp左右的序列中的六段位置实现，链置换酶发挥链置换作用来形成环介导等温扩增核心元件，形成指数扩增。环介导等温扩增技术，引物设计简单，操作方便，对机器要求低，可以在水浴锅进行反应，非常适合基层临床实时检测。同时，由于环介导等温扩增中会产生焦磷酸盐沉淀，从外观上会直接表现出浑浊度的变化，可以直接肉眼观察，初步筛选。也可以通过核酸染料进行实时荧光检测，从荧光曲线Ct值判断反应进行情况。技术选择性非常多，非常适合临床实时检测的要求，可以在1h内直接出诊断报告，极大压缩诊断消耗的时间。
[0004]现行的标准日本脑炎诊断流程包括样本采集，核酸提取以及扩增检测，整个流程大约需要2
–
3h，非常耗时。
[0005]等温扩增以其快速反应特征，可以极大减少检测流程时间。利用恒温扩增的快速和精确诊断的特点，可以替代PCR诊断方法，提高检测速度，达到检测灵敏度，显著减少整个日本脑炎病毒检测时间。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种检测速度块、检测灵敏度高的基于核酸恒温扩增的日本脑炎检测试剂盒。
[0007]本专利技术提供的基于核酸恒温扩增的日本脑炎检测试剂盒，包括引物组，扩增反应试剂。
[0008]本专利技术根据NCBI中日本脑炎病毒基因组包膜蛋白E基因片段(见SEQ ID NO.5所示)设计引物组，引物组具体为上游外部引物F3、下游外部引物B3、上游内部引物FIP和下游
内部引物BIP，依次为SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.4所示；
[0009]所述扩增反应试剂，包括：Bst DNA聚合酶8U，Mulv逆转录酶8U，UNG酶8U，1mM dNTP，1mM dUTP，20mM Tris
‑
HCl，10mM(NH4)2SO4，50mM KCl，0.1％ Tween20，2mM MgSO4，5
×
SYBR GREENⅠ。利用链置换Bst DNA聚合酶和Mulv逆转录酶以及特殊发卡引物在恒温条件下构造特异性扩增元件，利用UDG酶去除气溶胶污染，实现核酸指数扩增，保证扩增的高度灵敏度和快速性。
[0010]本专利技术中，利用链置换Bst DNA聚合酶和Mulv逆转录酶以及特殊发卡引物在恒温条件下构造特异性扩增元件，利用UDG酶去除气溶胶污染，实现核酸指数扩增，保证扩增的高度灵敏度和快速性。
[0011]所述试剂盒，还包括阳性质控以及阴性对照，阳性对照为日本脑炎病毒假病毒，阴性对照为无核酸酶水(无RNA酶和DNA酶的去离子水)。
[0012]进一步地，所述外引物F3浓度为0.2
‑
0.4μM，外引物B3浓度为0.2
‑
0.4μM，内引物FIP浓度为1.4
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1.8μM，内引物BIP浓度为1.4
‑
1.8μM。
[0013]进一步地，所述扩增反应试剂中，可通过加入添加剂如二甲基亚砜、单链结合蛋白、海藻糖和PEG8000来改变荧光曲线到达平衡点的时间；添加剂可以是一种，也可以是两种的组合，也可以是三种的组合，例如是10％的二甲基亚砜、15％的海藻糖、15％的PEG8000或者5μg的单链结合蛋白。
[0014]所述试剂盒，还包括试剂盒的使用说明。
[0015]本专利技术的基于核酸恒温扩增的日本脑炎检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
[0016](1)采用标准方法采集脑脊液样本；
[0017](2)使用Qiagen核酸提取试剂盒进行样本核酸提取；
[0018](3)对提取核酸分别进行检测，分别进行阳性对照反应和阴性对照反应；
[0019](4)反应结束后观察荧光曲线变化，若为S型曲线且反应出峰时间在35min以前，则判断阳性，否则阴性。
[0020]本专利技术的优势在于：
[0021](1)针对日本脑炎病毒的包膜蛋白E基因的6个区域设计4条特异性引物，扩增产物具有高度特异性；本专利技术在恒温条件下反应，不需要价值昂贵、步骤繁琐的温度循环仪器，降低了检测成本；
[0022](2)UNG酶和dUTP的加入可以去除扩增产物气溶胶污染，进一步降低检测环境污染和扩增结果假阳性；
[0023](3)本专利技术从样本采集后到核酸扩增结果，整个流程约1h，极大缩短反应时间；仅需要观察荧光曲线判断反应结果，可以减少气溶胶污染；
[0024](4)本专利技术的试剂盒具有特异性强、灵敏度高、节省时间等优势；检测日本脑炎病毒方便快捷、成本低廉，适合现场快速检测。
附图说明
[0025]图1为本专利技术的恒温扩增检测日本脑炎病毒临床样本结果。
[0026]图2为本专利技术的恒温扩增检测试剂盒的灵敏度检测结果。
具体实施方式
[0027]实施例1，引物设计
[0028]外部引物组的Tm值应该在55
–
63℃，碱基长度在15
–
25个。内部引物组5
’
端20个碱基左右的Tm值要高于其他引物组Tm值，控制在60
–
68℃，内部引物组3
’
端20个碱基左右的Tm值在55
–
63℃。所有引物的GC含量控制在30％
‑
65％，需要保证引物的5
’
端和3
’
端稳定性，需要避免引物自身和引物之间形成二聚体。引物锚定在靶序列上的位置有着严格的要求，外部引物组之间的碱基长度控制在160
‑
220，相对应的内部引本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于核酸恒温扩增的日本脑炎检测试剂盒，其特征在于，包括引物组、扩增反应试剂；所述引物组根据NCBI中日本脑炎病毒基因组包膜蛋白E基因片段SEQ ID NO.5设计，具体为上游外部引物F3、下游外部引物B3、上游内部引物FIP和下游内部引物BIP，依次为SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.4所示；所述扩增反应试剂包括：Bst DNA聚合酶8U，Mulv逆转录酶8 U，UNG酶8U，1mM dNTP，1mM dUTP，20mM Tris
‑
HCl，10mM (NH4)2SO4，50mM KCl，0.1% Tween20，2mM MgSO4，5
ꢀ×ꢀ
SYBR GREEN
ꢀⅠ
。2.根据权利要求1所述三基于核酸恒温扩增的日本脑炎检测试剂盒，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：张童，隋国栋，卢大儒，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：