大豆锈病菌的检测靶标、LAMP引物、试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测大豆锈病菌的LAMP引物组合物、试剂盒及其检测方法。提取待检微生物的DNA，取DNA溶液作为反应模板，加入试剂盒中的检测溶液进行LAMP反应，LAMP反应程序为：62℃反应扩增70min，然后在扩增产物中加入SYBRGreenI，观察颜色变化，如果颜色由橙色变为黄绿色，或在紫外灯下有荧光，表示待检物中存在大豆锈病菌，如果颜色没有变化仍是橙色，或在紫外灯下无荧光，则表示待检物中不存在大豆锈病菌。本发明专利技术具备更高的准确性、灵敏度和实效性，而且操作方便、实用性好，为大豆锈病菌的检测提供了新的技术平台，可用于大豆锈病菌的高灵敏度快速检测。病菌的高灵敏度快速检测。病菌的高灵敏度快速检测。

【技术实现步骤摘要】
大豆锈病菌的检测靶标、LAMP引物、试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术属于生物技术检测领域，涉及大豆锈病菌的检测靶标、LAMP引物、试剂盒及其检测方法。

技术介绍

[0002]大豆锈病菌(Phakopsora pachyrhizi)属于担子菌门(Phylum Basidiomycota)、锈菌纲(Class Urediniomycetes)、锈菌目(OrderUredinales)、层锈菌科(Family Phakopsoraceae)、层锈菌属(Genus Phakopsora)，可引起大豆叶片黄化、脱落和植株早枯；或造成空荚和荚数减少，在大豆生产中造成严重的经济损失。迄今为止，尚无商业化的抗病品种投入使用，而杀菌剂的及时使用是防控该病害最为有效的措施。加强病害预警监测，建立快速检测方法，为病害的风险及用药决策提供依据，有利于降低大豆锈病菌引起的损失。
[0003]目前，针对大豆锈病菌的检测技术较少。传统的检测方法主要是依据大豆锈病菌的形态学进行鉴定。由于大豆锈病菌是活体营养专性病原菌，不能在人工培养基上生长，给检测带来了巨大困难。随着分子生物学的发展，特别PCR技术的普及，越来越多的分子生物学技术被开发应用到病原菌的检测中，然而大豆锈病菌的检测发展缓慢，此外这些技术在特异性和灵敏度上有了较大的提高，并且检测时间较长，同时依赖精密的温度循环装置，检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。
[0004]环介导等温扩增技术(Loop
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mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新的核酸扩增技术，因其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围80min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物白色焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。自LAMP检测技术建立以来，该技术已经广泛应用于对细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原菌的检测研究，但在植物病原锈菌的检测上报道很少，大豆锈病菌的检测国内外均未见报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术通过序列比对分析大豆锈病菌和其它60个锈菌菌株在基因组序列上的差异，以Phapa_Oyhb的基因序列为靶标设计了大豆锈病菌特异性的LAMP引物组合物，在此基础上建立了大豆锈病菌的LAMP快速检测方法。
[0006]本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种大豆锈病菌Phakopsorapachyrhizi的特异性检测靶标Phapa_Oyhb，所述检测标靶的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
[0008]ATGCTGAGTACTAGGGTTATCATGAAGCTGATCCTGCTCGGTGTTTTTTCAAACCTTCTGATTGTTGC
CTGTGATGAGGGCTTTAACTGTAAGGATCCGTCTAAGGGTCATCCGCACCGTCTGGTGAATGCTACCCAATGTGTAAAGTCAGTAAAAATAAAAATCATCTGATACATCAAACAATCCAATCCTCTTCTCACTATCTGTTTTGAAAGGATAATTAATCAGAAGATACCTAAATAACCTCAAAAGATCTGATCTTCTTCCCCCTCTTTTGTACCATCAGTGCCATCAAATCGTTTCCAGTCATAAATGGTGATTTCTCTGTTTCGTTGAACCCAGCCAAAAGTTACGTACGACACTGTGGGACTTGTAAAGTTAAGTATAAAACATAACGCAAAGATCTATCAGATCGAACATTCGATGATTCAAGCACCAGAGGGAGTGACAAGATGAGAGAATCTTTTTGTGAAGGACTCAGTGTTTGATAAGAATCAAAGAGGATGATAGAAATAGGGATGGAGGAGAGACTGATATAGTTGTTGATAAGACTAACGATCAGAGCTTCTCTCAGACTGATGGGTCATCTTCTTCTCTCTATCAATAAATTAGCTTGAACTGAGTGGATCTGAAAAGGCCAAACAAGCAGGACTGCCTCTGTAAGTTTTCTCTGTTTCCCTCTTTAACAGAAAAACACAATCAATAACAGAGTGAGAGGGATGACGTAAGGTACTGACACCTTTCGGAGCTGGGTCTTCTTCTCTTAATAGTGCAAAAGATGAAACGTTGATCAAGATAAAGGATGCTGTTAACCACTGTAATAACGATGTGTGTAATTTAAAATATAAATAATCTTGTAACTGGCAGTTCATATATGAGCGTTGGCGGCTGACCTTCTATACCCTATAAAAAAAAAGTCGTATGGAGATTTTTCAATGTACAACGAGAGGAGTAAAGTCACTGTTCGAATCGACTGGGAATACTCTACGAAAGGTGCCTACTGCCCC(SEQ ID NO：1)
[0009]第二方面，本专利技术提供了一种用于检测大豆锈病菌Phakopsora pachyrhizi的LAMP引物组合物，所述引物组合物包含：如SEQ ID NO.2所示的正向内引物FIP，如SEQ ID NO.3所示的反向内引物BIP，如SEQ IDNO.4所示的正向外引物F3，如SEQ ID NO.5所示的反向外引物B3，如SEQ ID NO.6所示的反向环引物LB。
[0010]第三方面，本专利技术还提供了上述引物组合物在检测大豆锈病菌Phakopsorapachyrhizi中的应用。
[0011]第四方面，本专利技术还提供了上述引物组合物在制备检测大豆锈病菌Phakopsorapachyrhizi试剂盒中的应用。
[0012]第五方面，本专利技术还提供了一种检测大豆锈病菌Phakopsorapachyrhizi的LAMP试剂盒，所述的试剂盒中各试剂浓度为：0.8μM正向内引物FIP、0.8μM反向内引物BIP、0.1μM正向外引物F3、0.1μM反向外引物B3、0.1μM反向环引物LB、0.8M甜菜碱、1.4mM dNTPs、20mM Tris
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HCl、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、6mM MgSO4、0.1％Triton X
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100、Bst DNA polymerase 8U/μl，使用超纯水配制成1mL检测溶液；其中正向内引物FIP如SEQ ID NO.2所示，反向内引物BIP如SEQ ID NO.3所示，正向外引物F3如S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大豆锈病菌Phakopsorapachyrhizi的特异性检测靶标Phapa_Oyhb，其特征在于，所述检测标靶的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。2.一种用于检测大豆锈病菌Phakopsorapachyrhizi的LAMP引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包含：如SEQ ID NO.2所示的正向内引物FIP，如SEQ ID NO.3所示的反向内引物BIP，如SEQ ID NO.4所示的正向外引物F3，如SEQ ID NO.5所示的反向外引物B3，如SEQ ID NO.6所示的反向环引物LB。3.权利要求2所述的引物组合物在检测大豆锈病菌Phakopsorapachyrhizi中的应用。4.权利要求2所述的引物组合物在制备检测大豆锈病菌Phakopsora pachyrhizi试剂盒中的应用。5.一种检测大豆锈病菌Phakopsorapachyrhizi的LAMP试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中各试剂浓度为：0.8μM正向内引物FIP、0.8μM反向内引物BIP、0.1μM正向外引物F3、0.1μM反向外引物B3、0.1μM反向环引物LB、0.8M甜菜碱、1.4mMdNTPs、20mMTris
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HCl、10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、6mMMgSO4、0.1％TritonX
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【专利技术属性】
技术研发人员：叶文武，王源超，欧阳海兵，王晓莉，王燕，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：