本发明专利技术提供了一株产乳糖酶的米曲霉(Aspergillus oryzae)菌株，该菌株于2022年11月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为广州，保藏编号为GDMCC No.63004。本发明专利技术提供的米曲霉易培养，乳糖酶温度稳定性和酸性条件下的pH稳定性良好，在60℃，pH为4.5时活性最高。pH为4.5时活性最高。pH为4.5时活性最高。
【技术实现步骤摘要】
一株产酸性乳糖酶的米曲霉及其应用
[0001]本专利技术涉及微生物
，具体涉及一株可产乳糖酶的米曲霉菌及其应用。
技术介绍
[0002]乳糖酶，即β
‑
半乳糖苷半乳糖水解酶(β
‑
galactoside galactohydrolase，E.C.3.2.1.23)，具有催化乳糖水解生成半乳糖和葡萄糖并且具有一定的转糖基活性。乳糖酶在食品、医药、环境等领域都有广泛的应用，在食品和医药上主要用来解决乳糖不耐症。乳糖酶的天然来源十分丰富，广泛分布在动物、植物和微生物中，但目前研究发现，仅有微生物产生的乳糖酶在工业上具有应用价值。其中，黑曲霉、米曲霉等霉菌没有在安全性试验中出现过中毒的现象，被认为是安全菌株。霉菌产生的乳糖酶属于胞外酶，分离提取方便，其最适作用温度一般在50℃以上，具有较好的热稳定性。
[0003]米曲霉是一种好氧真菌，属于盘菌亚门、曲霉属，最初分离自日本制造清酒用的酒曲。多年来，在许多国家被用于不同食物如酱油等的发酵。虽然米曲霉和黄曲霉同属于曲霉属黄绿组，但米曲霉不产生黄曲霉毒素，因此被颁予了GRAS认证。分子和遗传鉴定技术通常无法区分黄曲霉和米曲霉两种真菌，最终要依靠形态和微观特征鉴别米曲霉。受不同培养基影响，米曲霉可以产生多种次级代谢产物，如萜类、香豆素类、氧化脂质和脂肪酸等，其具有不同的生物活性，如抗癌、细胞毒性、抗菌、抗高血压和抗病毒活性等。米曲霉还被用作许多工业酶的生产菌株，如中性和碱性蛋白酶、α
‑
淀粉酶、糖化酶、脯氨酰内肽酶、纤维素酶、天冬酰胺酶、脂肪酶、果胶酶、β
‑
半乳糖苷酶等。
技术实现思路
[0004]本专利技术的第一个目的是提供一株可产乳糖酶的米曲霉菌株，所述米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）于2022年11月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCCNo.63004。
[0005]所用培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)，25
‑
30℃有氧条件培养。
[0006]所述米曲霉的DNA序列为SEQ ID NO.1。
[0007]所述米曲霉菌是从浙江省宁波市滩涂海水中分离得到的。
[0008]本专利技术的第二个目的是提供一株米曲霉菌株在表达乳糖酶中的应用。
[0009]所述米曲霉表达的乳糖酶的最适反应温度为60℃，40
‑
65℃活性较高。
[0010]所述米曲霉表达的乳糖酶在4
‑
60℃热稳定性良好。
[0011]所述米曲霉表达的乳糖酶的最适反应pH为4.5，pH为4
‑
5时活性较高。
[0012]所述米曲霉表达的乳糖酶在pH为酸性时稳定性良好。
[0013]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0014]本专利技术分离和鉴定了一株可产乳糖酶的米曲霉菌株，通过基因组序列分析和构建系统发育树，结合在察氏酵母膏琼脂培养基(CYA)上的形态学特征和镜检结果，确定该菌株为米曲霉。
[0015]本专利技术提供的米曲霉易培养，乳糖酶温度和pH稳定性好，在温度为60℃，pH为4.5时活性最高。
附图说明
[0016]图1为实施例3中米曲霉菌株在PDA固体培养基上培养5d时的菌落形态(正面)；
[0017]图2为实施例3中米曲霉菌株在PDA固体培养基上培养5d时的菌落形态(反面)；
[0018]图3为实施例3中米曲霉菌株在显微镜下的形态图；
[0019]图4为实施例3中米曲霉菌株在CYA固体培养基上培养14d时的菌落形态(正面)；
[0020]图5为实施例3中米曲霉菌株在CYA固体培养基上培养14d时的菌落形态(反面)；
[0021]图6为实施例4中米曲霉菌株基于序列结果构建的系统发育树；
[0022]图7为实施例5中不同温度对乳糖酶酶活的影响图(乳糖酶最适反应温度)；
[0023]图8为实施例5中不同温度对乳糖酶酶活的影响图(乳糖酶热稳定性)；
[0024]图9为实施例6中不同pH值对乳糖酶酶活的影响图(乳糖酶最适反应pH)；
[0025]图10为实施例6中不同pH值对乳糖酶酶活的影响图(乳糖酶pH稳定性)。
具体实施方式
[0026]下面结合实施例对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。
[0027]实施例1：米曲霉菌株的筛选和获得。
[0028]1.培养基的配制
[0029]PDA培养基：土豆洗净去皮，称取200g切小块，在纯水中煮30分钟，用八层纱布过滤除去残渣，降温后加水定容至1L，pH为自然。如为固体培养基，则再加入琼脂20g，分装后于121℃灭菌20分钟。50％葡萄糖：称取50g葡萄糖，加水溶解并定容至100mL，115℃灭菌30分钟。
[0030]PDA固体平板：将灭菌后的PDA培养基冷却至60℃左右，添加20g/L葡萄糖和20mg/mL X
‑
gal，倒注平板，凝固后备用。
[0031]CYA固体平板：NaNO
3 3.0g/L，K2HPO
4 1.0g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·
7H2O 0.5g/L，FeSO4·
7H2O 0.01g/L，酵母膏5.0g/L，蔗糖30.0g/L，琼脂15.0g/L。将灭菌后的CYA培养基倒注平板，凝固后备用。
[0032]2.菌株的筛选和获得
[0033]样品采集：2022年7月13日于浙江省宁波市近海滩涂(E 122
°
49
′
51
″
,N 29
°
47
′
52
″
)采集的海水样本，存放于无菌瓶中。
[0034]菌株筛选和获得：样本经无菌水梯度稀释后，采用平板涂布的方式分布于PDA固体培养基上，编号并贴封口膜，于30℃生化培养箱中倒置培养3
‑
5天。通过平板初筛，在平板上发现一株显蓝色的真菌，将其点接于PDA固体培养基上，进行富集纯化。
[0035]实施例2：米曲霉菌株的乳糖酶酶活测定。
[0036]1.缓冲液及试剂配制
[0037]醋酸盐缓冲液：吸25mL 2N乙酸，加入约300mL水，并用2N NaOH溶液调pH至4.5。将溶液转移到500mL容量瓶中，定容。10％Na2CO3溶液：称取50g无水碳酸钠，用少量去离子水溶解，并在500mL容量瓶中定容。底物：称取185.0mg ONPG(o
‑
nitrophenyl
‑
β...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一株产乳糖酶的米曲霉(Aspergillus oryzae)菌株，其特征在于，于2022年11月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为广州，保藏编号为GDMCC No.63004。2.根据权利要求1所述的一株产乳糖酶的米曲霉菌，其特征在于，所用培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)，25
‑
30℃有氧条件培养。3.根据权利要求1所述的一株产乳糖酶的米曲霉菌，其特征在于，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。4.根据权利要求1所述的一株产乳糖酶的米曲霉菌，其特征在于，所述米曲霉菌是从浙江省宁波市滩涂海水中分离得到的。5.如权利要求1
‑
4任一所述的一株米曲霉...
【专利技术属性】
技术研发人员：田健，林新月，诸辉，曹阳，吴吕平，
申请(专利权)人：宁波希诺亚海洋生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。