一种新的肌肉特异性启动子制造技术

本发明专利技术涉及一种新的短启动子，其特征在于在骨骼肌中具有高活性，而在心脏中具有低活性。因此，它构成了一个有价值的候选者，特别是用于驱动编码对治疗肌营养不良症有用的蛋白质的转基因的表达。质的转基因的表达。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种新的肌肉特异性启动子


[0001]本专利技术基于一种新的启动子的鉴定，该启动子具有较小的尺寸和目的表达谱，即在骨骼肌中具有高活性而在心脏中具有低活性。然后，它提供了一种有价值且安全的治疗工具，例如用于驱动编码对治疗肌营养不良症有用的蛋白质的转基因的表达。

技术介绍

[0002]肌营养不良症(MD)是一组肌肉疾病，随着时间的推移，会导致骨骼肌的日益衰弱和分解。这些病症在主要受到影响的肌肉的种类、衰弱的程度、其恶化的速度以及症状开始的时间上有所不同。许多人最终会变得无法行走。有些类型还与其他器官的问题有关。在一些肌营养不良症的病例中，也会观察到心肌病。
[0003]肌营养不良症组包含30种不同的遗传性病症，通常被分为九个主要类别或类型。最常见的类型是杜氏肌营养不良症(DMD)，它通常从四岁左右开始影响男性。其他类型包括贝克肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、肢带型肌营养不良症(LGMD)和强直性肌营养不良。它们是由于参与制造肌肉蛋白的基因发生了突变。这可能是由于从父母那里继承了缺陷或在早期发育过程中发生了突变。病症可能是X连锁隐性遗传、常染色体隐性遗传或常染色体显性遗传。诊断通常涉及血液检查和基因测试。
[0004]肌营养不良症是无法治愈的。物理疗法、支架和矫正手术可能有助于缓解一些症状。对于那些呼吸肌衰弱的人，可能需要辅助通风。使用的药物包括减缓肌肉退化的类固醇、控制癫痫发作和一些肌肉活动的抗惊厥药以及延缓垂死肌肉细胞损伤的免疫抑制剂。预后取决于病症的特定类型。
[0005]基因疗法作为一种治疗方法，正处于人类研究的早期阶段。它通常是基于携带编码在待治疗的受试者中发生了突变的野生型蛋白质的转基因的表达系统的全身施用。
[0006]在基因疗法方面，安全的表达系统被定义为确保在靶组织中，即在需要所述蛋白质来治愈与天然蛋白质缺乏有关的异常的组织中，产生治疗有效量的蛋白质而不显示任何毒性，特别是在基本和重要器官或组织中。在肌营养不良症方面，靶组织涉及骨骼肌，可能还涉及心脏。
[0007]对转基因表达的严格调节似乎是一个关键因素。例如，文件WO2014/167253报道，在人类结蛋白(desmin)启动子控制下，全身施用包含编码肌微管素(myotubularin)(以治疗X连锁肌管性肌病或XLMTM)或钙蛋白酶3(calpain3)(以治疗肢带型肌营养不良症2A型或LGMD2A)的核酸序列的AAV载体会导致肌肉拯救，但与心脏毒性有关。
[0008]存在许多用于高效肌肉表达的启动子。例如，Brennan等人(The Journal of Biological Chemistry,1993,268(1):719
‑
25)报道，人类α肌动蛋白ACTA1基因(SEQ ID NO:1)的
‑
2000至+239区域允许在成人骨骼肌中高水平表达，以及横纹肌特异性表达和在发育过程中正确调节。然而，这种启动子的大尺寸(2239个核苷酸)使它不适合大量的应用。
[0009]在骨骼肌α肌动蛋白基因启动子区域方面：
[0010]Muscat等人(Mol.Cell.Biol.,1987,7(11):4089
‑
99)已经鉴定了人类基因的多个
5
’‑
侧翼区域，它们协同调节肌肉特异性表达。
[0011]Petropoulos等人(Mol.Cell.Biol.,1989,9(9):3785
‑
92)已经研究了鸡基因启动子的表达谱。
[0012]Muscat等人(Gene Expression,1992,2(2):111
‑
126)已经鉴定了人类骨骼α肌动蛋白基因中的肌肉特异性增强子。
[0013]此外，并且正如本申请中在结蛋白启动子方面所显示的，它们中的大多数在心脏中也显示出高活性，可能与心脏毒性有关。此外，通常观察到，启动子越小，越难获得表达的特异性。例如，一个具有高肌肉表达的小启动子是合成的C5
‑
12启动子(361个核苷酸)，它被证明在一些非肌肉细胞中有泄漏。
[0014]因此，本领域仍然需要设计尽可能小的转录元件，导致基因在骨骼肌细胞中的高水平和特异性表达，以达到蛋白质表达的治疗水平，并避免广泛的基因表达所固有的潜在副作用。

技术实现思路

[0015]本专利技术旨在提供合成启动子，这些启动子是肌肉特异性的，即在骨骼肌中的表达活性高于所有其他组织或器官，特别是心脏，同时尺寸小，以便与任何表达系统，特别是腺相关(AAV)载体兼容。
[0016]这些新型启动子可用于基因疗法，例如用于治疗神经肌肉疾病，包括肌营养不良症。
[0017]本专利技术涉及一种包含这种合成启动子的核酸分子。
[0018]本专利技术的启动子可与目的转基因可操作地连接。因此，本专利技术进一步涉及一种表达盒，其包含本文所述的核酸分子，可操作地与转基因连接。
[0019]本专利技术进一步涉及一种包含上述表达盒的载体。在特定实施方案中，该载体是质粒载体。在另一个实施方案中，该载体是病毒载体。
[0020]本专利技术还涉及一种包含根据本专利技术的核酸构建体的分离的重组细胞。
[0021]本专利技术进一步涉及一种药物组合物，其包含在药学上可接受的载体中的本专利技术的载体或分离的细胞。
[0022]此外，本专利技术还涉及本文公开的表达盒、载体或细胞用作药物。在这一方面，包含在表达盒、载体或细胞中的目的转基因是治疗性转基因。
[0023]本专利技术进一步涉及本文公开的表达盒、载体或细胞用于基因疗法。
[0024]在另一方面，本专利技术涉及本文公开的表达盒、载体或细胞用于治疗神经肌肉病症，例如肌营养不良症。
[0025]定义
[0026]除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。描述中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不旨在进行限制。
[0027]冠词“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”在本文中用于指代冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个)。举例来说，“一个要素”是指一个要素或多于一个要素。
[0028]在提及可测量的值(例如数量、持续时间等)时，本文所用的“约/大约(about)”或
“
约/大约(approximately)”是指涵盖指定值的
±
20％或
±
10％、更优选
±
5％、甚至更优选
±
1％、并且还更优选
±
0.1％的变化，因为这样的变化适合于执行所公开的方法。
[0029]范围：在整个本公开中，本专利技术的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应被解释为对本专利技术范围的不可更改的限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如从1到6的范围的描述应该被认为已经本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种启动子，其包含：
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序列SEQ ID NO:2；或
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与SEQ ID NO:2的同一性大于或等于90％的序列。2.根据权利要求1所述的启动子，其中其尺寸不超过350个核苷酸。3.根据权利要求1或2所述的启动子，其中它确保在骨骼肌中的表达水平高于在心脏中的表达水平。4.根据权利要求1至3中任一项所述的启动子，其中它包含序列SEQ ID NO:2或由其组成。5.一种表达系统，其包含根据权利要求1至4中任一项所述的启动子，以及有利地置于所述启动子控制下的转基因。6.根据权利要求5所述的表达系统，其中所述转基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：肌营养不良蛋白(包括微小肌营养不良蛋白、迷你肌营养不良蛋白、类似肌营养不良蛋白)、HSP
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40同源物B6、钙蛋白酶3、dysferlin、肌糖(α、β、γ、δ)、FKRP(Fukutin相关蛋白)和Anoctamin5。7.根据权利要求6所述的表达系统，其中所述钙蛋白酶3蛋白具有序列SEQ ID NO:8。8.根据权利要求5至7中任一项所述的表达系统，其中它进一步包含至少一个选自由以下组成的组的另外的序列：
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用于稳定转录本的序列，有利地是编码人β球蛋白(HBB2)的基因的内含子；
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多腺苷酸化信号，有利地是目的基因的polyA、SV40或β血红蛋白(HBB2)的polyA；
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【专利技术属性】
技术研发人员：威廉，
申请(专利权)人：国家健康与医学研究院埃夫里瓦尔德艾松大学，
类型：发明
国别省市：