一种调控芒草耐盐碱基因MsGRAS60及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种调控芒草耐盐碱基因MsGRAS60，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。MsGRAS60表达的蛋白产物为芒草GRAS转录因子，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术通过转化拟南芥，得到过表达MsGRAS60基因的转基因拟南芥，其种子在盐处理下，萌发率及绿苗率均显著下降，在碱处理下，萌发率及鲜重均显著下降，同时，MsGRAS60过表达显著降低了转基因拟南芥对ABA的敏感性。在盐碱胁迫处理下，转基因拟南芥总体表现出生长抑制的典型盐碱敏感表型，说明该基因为重要的调控植物耐盐碱的关键因子。因子。因子。

【技术实现步骤摘要】
一种调控芒草耐盐碱基因MsGRAS60及其应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种调控芒草耐盐碱的基因GRAS60及其应用。

技术介绍

[0002]据统计，截止2021年，全球盐渍土面积达到4.24亿公顷，占陆地面积的3.9%。同时，盐渍土的面积有进一步增大的趋势，相关报道，全球盐碱土地以每年1
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2百万公顷的速度不断增加，此外由于全球变暖和气候变化等环境因素影响，预计未来十年将这个数字将进一步增加。目前，盐碱地的治理主要是通过一些传统的物理的方法，但它们面临诸如成本高、费时费力、不环保等各种缺点。土壤盐碱化极大的影响着农业生产，从而严重制约着经济的发展。通过抗逆育种手段充分利用盐碱地，对增加作物产量、解决粮食危机意义重大。如何提高盐碱地作物的耐盐程度，特别是通过各种育种技术（如分子育种）提高植物的耐盐性成为近年来的研究热点。
[0003]芒草是一种多年生C4植物，具有光合作用效率高、生物量高、耐胁迫性好和环境适应性广等优点，已成为最有前景的生物能源作物之一。在盐渍土上种植芒草在盐渍土复垦、减排、碳封存和碳中和方面也具有重要意义，而且可为生物乙醇生产提供充足的原材料。然而，芒草的遗传改良远远落后于其他农作物，这主要是由于其复杂的遗传背景，以及盐胁迫耐受性中尚未明确的分子机制。挖掘和功能鉴定参与植物盐胁迫反应的关键基因是分子育种的先决条件，因此，迫切需要阐明芒草高耐盐碱的分子机制，为获取高耐盐碱性的转基因植株提供有效的理论指导。
[0004]GRAS是植物特有的转录因子，是以首次发现的GAI、RGA和SCR三个成员所命名。GRAS蛋白的C端是高度保守的，基于保守结构域，GRAS家族基因被分为八个亚家族，包括SCL3、SHR、PAT1、LISCL、DELLA、SCR、LS和HAM。GRAS转录因子在植物根茎的发育、分生组织的形成、赤霉素信号传导、光信号传导等过程中发挥着重要的作用。同时，GRAS转录因子也参与了植物非生物胁迫反应的调节，目前在拟南芥、水稻、番茄、杨树、油菜和大豆等植物中得到证实。尽管GRAS基因在调节植物发育和非生物胁迫耐受性中起着重要作用，目前，尚未有芒属植物的GRAS转录因子的相关报道，特别是在芒草GRAS的耐盐性方面的研究仍属于空白，因此，克隆芒草GRAS转录因子，开发利用新的耐盐基因，有助于阐明盐生植物高度耐盐碱的分子调节机制，为下一步耐盐芒草品种的选育打下基础，对盐碱地利用和农业综合生产能力提高具有重要应用价值。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种芒草基因MsGRAS60，该基因是调控芒草耐盐碱的关键基因。本专利技术通过盐胁迫、碱胁迫、盐碱混合胁迫后转录组测序，发现了在盐碱胁迫下表达显著上调的GRAS基因MsGRAS60，经过进一步的定量PCR分析，其在盐碱胁迫下表达量显著升高。进一步设计了MsGRAS60的克隆引物，构建
了MsGRAS60
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OX的植物过表达载体，转化拟南芥后使用潮霉素进行筛选，经过繁殖得到纯合体后，在添加不同浓度盐（NaCl）或碱（NaHCO3）的1/2 MS平板上进行生长，进一步对耐盐碱表型进行观察。本专利技术的另一目的是提供一种上述调控芒草耐盐碱的基因GRAS60的应用。
[0006]技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术提供了一种芒草耐盐基因MsGRAS60，所述芒草耐盐基因MsGRAS60的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。
[0007]本专利技术还提供了一种芒草耐盐基因MsGRAS60的获取方法，所述获取方法包括以下步骤：（1）选择幼嫩的芒草叶片提取RNA；（2）反转录获得的cDNA；（3）以反转录得到的cDNA为模板，用特异引物MsGRAS
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F以及MsGRAS
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R进行PCR扩增后回收目的片段并纯化。所述特异引物MsGRAS
‑
F和MsGRAS
‑
R序列如下：MsGRAS60
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F：5
’‑
gtcgacacgtggatccATGGAGCCAGGCGCG
‑3’
MsGRAS60
‑
R：5
’‑
cggccgcgccggatccGCGCCACGCGGAGGC
‑3’
（4）将纯化后PCR产物与经BamH I酶切的pCAMBIA1301载体片段进行同源重组反应，将经抗性筛选和PCR验证正确的单菌落进行测序，构建MsGRAS60的过表达载体MsGRAS60
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OX。
[0008]本专利技术还提供了所述的芒草耐盐基因MsGRAS60及所述的MsGRAS60基因过表达载体在拟南芥耐盐碱方面的应用。
[0009]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术通过转录组分析，并结合RT
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qPCR技术发现芒草GRAS家族成员MsGRAS60基因在盐胁迫响应过程中具有显著变化（图1），本专利技术克隆了芒草MsGRAS60基因，并构建了MsGRAS60基因过表达载体MsGRAS60
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OX，通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥，从而验证芒草耐盐基因MsGRAS60的功能。结果显示，过表达MsGRAS60基因的拟南芥其种子的在盐碱处理下，萌发率显著下降，即过表达MsGRAS60基因的植株耐盐碱性显著下降，说明MsGRAS60基因是调控植物耐盐碱的关键调节因子。本专利技术采用上述技术方案提供了一种芒草耐盐基因MsGRAS60发掘与功能验证体系，将为实现利用基因工程技术手段创制盐碱地土壤盐碱度预警植物及提高芒草耐盐性及种质遗传改良与种质创新提供重要理论基础。
[0010]有益效果：与现有技术相比，本申请的优点在于：本申请公开了一种调控芒草盐耐性的基因MsGRAS60，将MsGRAS60基因转入拟南芥，过表达MsGRAS60基因的拟南芥其植株耐盐碱性显著下降，说明MsGRAS60基因是调控植物耐盐碱的关键调节因子，可用于土壤盐碱度指示植物的育种，为芒草耐盐碱的基因表达调控分子机制提供理论研究依据和基因序列，在能源植物耐盐碱育种领域有重要应用价值。
附图说明
[0011]图1 转录组及RT
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qPCR技术分析MsGRAS60基因在盐碱胁迫下的表达情况（Control:对照，Salt:盐胁迫，Alkali：碱胁迫，Salt+Alkali:盐碱混合胁迫）；图2 MsGRAS60
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OX拟南芥和野生型拟南芥在盐胁迫下种子萌发情况；图3 MsGRAS60
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OX拟南芥和野生型拟南芥种子在盐胁迫下的绿苗率；
图4 MsGRAS60
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OX拟南芥和野生型拟南芥种子在碱胁迫下种子萌发情况；图5 MsGRAS60
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OX拟南芥和野生型拟南芥种子在碱胁迫下的鲜重比较；图6 MsGRAS60
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种调控芒草耐盐碱基因MsGRAS60及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.根据权利要求1所述一种调控芒草耐盐碱基因MsGRAS60及其应用，其特征在于，所述基因MsGRAS60氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。3.根据权利要求1所述的一种调控芒草耐盐碱基因MsGRAS60及其应用，其特征在于：克隆所述MsGRAS60基因的方法是以芒草幼嫩叶片的cDNA为模板，利用引物MsGRAS60
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F和MsGRAS60
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R进行PCR扩增获得MsGRAS60全长片段，构建由35S启动子驱动的MsGRAS60的植物过表达载体，用于拟南芥遗传转化，分析并鉴定转基因拟南芥的耐盐碱性。4.根据权利要求3所述的芒草耐盐碱基因MsGRAS60的克隆，其特征在于：所述引物MsGRAS60
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F和MsGRAS60
‑
R的序列如下：MsGRAS60
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F：5
’‑
gtcgacacgtggatccATGGAGCCAGGCGCG

【专利技术属性】
技术研发人员：李胜军，胡瑞波，贺郭，赵旭红，徐艳，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：