分子数测定装置及分子数测定方法制造方法及图纸

本发明专利技术提供一种分子数测定装置及分子数测定方法，其可以通过将光量的测量值与单个分子的理论光量进行比较，计算试样中的分子数。基于与分子数有相关性的光量而定量地测定试样的分子数。该分子数测定方法具有：计算单个分子的理论光量的步骤；使用摄像系统测量试样的光量的步骤；以及基于测量出的试样的光量和计算出的理论光量之比，计算试样的分子数的步骤。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基于与分子数有相关性的光量而定量地测定试 样的分子数的分子数测定方法及分子数测定装置。
技术介绍
作为读取DNA微阵列(microarray)的装置，己知有微阵列扫 描仪。通过使用微阵列扫描仪扫描并读取DNA微阵列的图像，可以 将目标分子的荧光光量分布作为2维图像进行测定。专利文献l:特开2004—191232号公报
技术实现思路
但是，在上述微阵列扫描仪中，由于荧光光量是使用PMT (光 电倍增管Photomultiplier)在电流放大的同时进行测定的，所以难 以使其与照射在试样上的激励光量具有相关性。因此，荧光强度通常以任意单位表示。另外，由于不具有激励光等测定条件的校正单元， 所以虽然可以在1个画面内进行相对测定，但多次测定或设备之间的 数据无法直接比较。另一方面，激励光等光量均匀的光量可以由光电二极管等以可 溯源(traceable)至国家标准的方式进行测定，但得到的并不是图像， 而仅是零维的点的数据。与此相对，在特开2004—191232号公报中，公开了一种将照相 机的亮度值校正为国家标准中的光功率(W)的方法。由此，可以对 应于拍摄到的图像的每个像素而得到可溯源至国家标准的光功率的 光量值(下面称为"图像功率计")。但是，没有记载具体的分子计数 计算法。另外，表达式仅涉及吸收，没有公开与发光或荧光、以及测 定系统相关的计算式。本专利技术的目的在于提供一种分子数测定装置及分子数测定方 法，其可以通过将光量的测量值与单个分子的理论光量进行比较，计 算试样中的分子数。更具体地说，例如可以实现下述课题。(1) 示出一种具体方法，其利用具有光量单位的绝对值进行 荧光量等的评价，从而可以在多次测定或测定设备之间进行比较，而 该荧光量的评价在现有技术中只能进行相对比较。(2) 示出一种具体方法，其根据试样的光量(荧光、发光、 吸光)和规定的测定条件，推定试样中存在的分子数。(3) 示出一种具体方法，其通过与上述特开2004—191232号 公报所公开的方法一起使用，不仅能够得到零维的点的信息，还可以 根据2维的照相机图像本身，得到每个像素的光量，所以同样地，通 过对应于图像的每个像素进行分子数的推定，从而可以测定试样上的 荧光分子数的空伺分布。本专利技术的分子数测定方法基于与试样的分子数有相关性的光量，对上述分子数定量地进行测定，其特征在于，具有计算单个分 子的理论光量的步骤；使用摄像系统测量上述试样的光量的步骤；以 及基于测量出的上述试样的光量和计算出的上述理论光量之比，计算 上述试样的分子数的步骤。根据该分子数测定方法，由于基于测量出的试样的光量和计算 出的理论光量之比来计算试样的分子数，所以可以根据测量出的试样 光量直接导出分子数。本专利技术的分子数测定方法还可以具有对上述摄像系统的光量和 输出值之间的对应关系进行校正的步骤，在测量上述试样的光量的步 骤中，使用校正后的上述对应关系测量上述试样的光量。与上述分子数有相关性的光量可以是从上述试样发出的荧光的 荧光量，在计算上述理论光量的步骤中，使用摩尔吸光系数、量子效 率、激励波长效率及激励光量计算作为上述理论光量的理论荧光量。与上述分子数有相关性的光量还可以是上述试样的吸光量。与上述分子数有相关性的光量还可以是上述试样的发光量。上述摄像系统也可以具有共焦光学系统。本专利技术的分子数测定装置基于与试样的分子数有相关性的光 量，对上述分子数定量地进行测定，其特征在于，具有理论光量计 算单元，其计算单个分子的理论光量；光量测量单元，其使用摄像系 统测量上述试样的光量；以及分子数计算单元，其基于测量出的上述 试样的光量和计算出的上述理论光量之比，计算上述试样的分子数。根据该分子数测定装置，由于基于测量出的试样的光量和计算 出的理论光量之比来计算试样的分子数，所以可以根据测量出的试样 的光量直接导出分子数。专利技术的效果根据本专利技术的分子数测定方法，由于基于测量出的试样的光量 和计算出的理论光量之比来计算试样的分子数，所以可以根据测量出 的试样的光量直接导出分子数。根据本专利技术的分子数测量装置，由于基于测量出的试样的光量 和计算出的理论光量之比来计算试样的分子数，所以可以根据测量出的试样的光量直接导出分子数。 附图说明图1是表示用于进行荧光测定的试样测定装置的光学配置等结 构的图。图2是表示照相机的校正步骤的图。 图3是例示使用照相机读取的图像的图。 图4是表示与激励光测定相关的概念的图。 图5是表示Cy5-UTP的实测分子数的图。 图6是激励波长效率的说明图。具体实施方式下面，参照图1 图5说明本专利技术所涉及的分子数测定方法的实 施方式。实施例1在本实施例中，对将本专利技术用于"根据荧光光量进行荧光分子 数分布的测定(荧光测定)"的例子进行说明。图1是表示用于进行荧光测定的试样测定装置的光学配置等结 构的图。如图l所示，来自光源1的激励光2通过分色镜3折返而照射 试样4的整个区域。来自试样4的荧光5透过分色镜3入射至感光光 学系统6，在照相机7的摄像面上形成试样4的像。另外，照相机7 与执行后述一系列处理的运算装置8连接。运算装置8作为理论光量 计算单元、光量测量单元及分子数计算单元起作用。在将本专利技术的分子数测定方法应用于利用荧光光量进行荧光分 子数分布的测定(荧光测定)的情况下，例如可以通过依次执行下述 4个步骤，测定试样上的荧光量和荧光分子数的空间分布。另外，下 面的"测定面积"如后述所示，表示照相机的1个像素或lpm2等与光 轴成直角方向上的空间测定面积的1个单位。a) 测定照相机常数和试样的激励光量(W/m2) 对试样测定装置所使用的照相机系数(W，s/m2/LSB)和实际照射在试样上的激励光的单位面积的测定值(W/m2)进行测定，准 备试样测定装置。b) 推定单个分子的理论荧光量(W)根据测定对象的荧光分子的摩尔吸光系数s、量子效率、激励波 长效率及激励光量(W/m2)，推定(计算)"单个分子的理论荧光 量(W)"。c) 测定试样的单位测定面积的荧光量(W) 根据实际对试样进行拍摄而获得的照相机的像素的读取阶度值(LSB)、读取的累计时间(s)及照相机系数(W's/m2/LSB)， 测定所指定的像素的"试样的单位测定面积的荧光量(W)"。该荧光 量是可溯源至国家标准的值。d) 测定单位测定面积的试样分子数通过将在上述c)步骤中测定出的"试样的单位测定面积的荧光 量(W)"除以在b)步骤中得到的"单个分子的理论荧光量(W)"，可以测定(推定)"单位测定面积的试样分子数"。下面示出进行荧光测定的情况下的具体运算内容。a) 测定照相机系数和试样的激励光量(W/m2)对试样测定装置所使用的照相机系数(W，s/mVLSB)和实际 照射在试样上的激励光的单位面积的测定值(W/m2)进行测定，准 备试样测定装置。al)通过照相机校正来确定照相机系数Kc照相机系数Kc是特开2004—191232号公报所示的照相机固有 的校正值，随着测定波长的不同而成为不同的值，但具体内容并没有 在特开2004—191232号公报中公开。照相机系数Kc利用下述方法 求出。图2是表示照相机的校正步骤的图。al.l) 校正基准发光源光量通过专用的光量测定装置(功率计)测定。如图2所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分子数测定方法，其基于与试样的分子数有相关性的光量，对上述分子数定量地进行测定，　其特征在于，具有：　计算单个分子的理论光量的步骤；　使用摄像系统测量上述试样的光量的步骤；以及　基于测量出的上述试样的光量和计算出 的上述理论光量之比，计算上述试样的分子数的步骤。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：田名网健雄，青木秀年，佐藤纱绫，杉山由美子，
申请(专利权)人：横河电机株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]