用于检测O1群霍乱弧菌的引物、试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测O1群霍乱弧菌的引物、试剂盒和检测方法，本发明专利技术的检测方法成本低、检测时间短，操作简单，相比于PCR检测，本申请的试剂成本不到市场荧光PCR法的二分之一，相比于霍乱弧菌分离与鉴定方法，精度更高，极大地降低了漏检率。本发明专利技术的试剂盒具有准确率高、特异性好、灵敏度高的特点，适合大规模生产和应用。产和应用。产和应用。

【技术实现步骤摘要】
用于检测O1群霍乱弧菌的引物、试剂盒和检测方法


[0001]本专利技术属于病菌检测
，更具体地，涉及一种用于检测O1群霍乱弧菌的引物、试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是人类霍乱的病原体,霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐，腹泻，失水，死亡率甚高。霍乱弧菌是革兰氏阴性菌，菌体短小呈逗点状，有单鞭毛、菌毛，部分有荚膜。共分为200多个血清群，其中O1群和O139群可引起霍乱。目前,霍乱弧菌的检测多以传统细菌培养方法为主,存在着检出率偏低,费时费力等缺点，PCR已用于病原菌的检测，由于众多PCR方法的性能差异很大，不同PCR的检测能力参差不齐，且需昂贵仪器设备，成本高，且只能在设置齐全的实验室进行，实验时间长；环介导等温扩增(LAMP)方法的灵敏度接近或超过PCR，作为一种快速高效的实验方法，可肉眼观察判断结果，不依赖仪器设备就能实现现场快速检测，国内外还没有LAMP检测O1群霍乱弧菌研究报道。
[0003]本专利技术的目的是提供一种基于环介导等温扩增技术检测O1群霍乱弧菌引物、试剂盒和检测方法，能够快速、准确检测O1群霍乱弧菌，以适合霍乱流行病学调查和现场检测。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术提供一种用于检测O1群霍乱弧菌的引物、试剂盒和检测方法，能够快速、准确检测O1群霍乱弧菌，以适合霍乱流行病学调查和现场检测。
[0005]为实现上述目的，按照本专利技术的一方面，提供一种用于检测O1群霍乱弧菌的引物，其特征在于，包括：
[0006]上游外引物F3：5
’‑
CATTACCATTATCCATGGCC
‑3’
，SEQ ID NO：1；
[0007]下游外引物B3：5
’‑
GGCAAGTGGAATTATTTTTACCTTA
‑3’
，SEQ ID NO：2；
[0008]上游内引物FIP：
[0009]5’‑
AGCACTTTTGACGAATAATATCGGAGACTTTCTCTCTTTATTTGGCTC
‑3’
，SEQ ID NO：3；
[0010]下游内引物BIP：
[0011]5’‑
TGCCTGAATTTACAGGCTTACGCGATCGCCAACCCAAGTTGG
‑3’
，SEQ ID NO：4；
[0012]反向环引物LB：5
’‑
ATCACCACAATATGCACACACA
‑3’
，SEQ ID NO：5。
[0013]进一步的，所述上游外引物F3和下游外引物B3用于识别O1群霍乱弧菌特异性检测基因的靶序列。
[0014]进一步的，所述上游内引物FIP、下游内引物BIP和反向环引物LB用于扩增O1群霍乱弧菌特异性检测基因的靶序列。
[0015]按照本专利技术的第二方面，提供一种用于检测O1群霍乱弧菌的试剂盒，包括：引物混合液，所述引物混合液包括上述的引物。
[0016]进一步的，还包括：反应混合液、Bst酶、指示剂、阳性对照和阴性对照；
[0017]所述反应混合液包括：Tris
‑
HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Triton
‑
X 100和dNTPs；
[0018]所述Bst酶包括：Bst 2.0DNA Polymerase；
[0019]所述指示剂包括：Calcein、MnCl2和DMSO；
[0020]所述阳性对照包括：O1群霍乱弧菌DNA；
[0021]所述阴性对照包括：H2O。
[0022]进一步地，所述反应混合液包括：40mmol/L Tris
‑
HCl，20mmol/L KCl，20mmol/L(NH4)2SO4，16mmol/L MgSO4，0.2％Triton
‑
X 100，pH8.8的2.8mmol/L dNTPs；
[0023]所述Bst酶包括：8000U/ml的Bst 2.0DNA Polymerase；
[0024]所述指示剂包括：0.65mmol/L Calcein，7.8mmol/L MnCl2，体积分数为50％的DMSO；
[0025]所述阳性对照包括：1pg/μl O1群霍乱弧菌DNA；
[0026]所述阴性对照包括：H2O。
[0027]按照本专利技术的第三方面，提供一种用于检测O1群霍乱弧菌的检测方法，包括以下步骤：
[0028]提取待测样品的DNA；在PCR管中加入所述DNA，采用所述的试剂盒进行检测。
[0029]进一步的，所述提取待测样品的DNA前还包括：对待测样品中菌落进行扩增培养。
[0030]进一步的，所述检测的结果可用肉眼观察，也可采用通过浊度仪测试浊度。
[0031]总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
[0032]1.本专利技术的检测方法，成本低、检测时间短，操作简单，相比于PCR检测，本申请的试剂成本不到市场荧光PCR法的二分之一，相比于霍乱弧菌分离与鉴定方法，精度更高，极大地降低了漏检率。
[0033]2.本专利技术的试剂盒具有准确率高、特异性好、灵敏度高的特点，适合大规模生产和应用。
附图说明
[0034]图1为LAMP特异性检测结果图(其中1:VP，2:VA，3:VF，4:VC，5:O139，6:H2O，7:O1)；
[0035]图2为未加指示剂时LAMP检测浊度曲线图；
[0036]图3为加指示剂时LAMP检测浊度曲线图；
[0037]图4为未加指示剂LAMP反应灵敏度结果图(其中1
‑
8分别是1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl的O1群霍乱弧菌DNA浓度的样品和H2O)；
[0038]图5为加指示剂LAMP反应灵敏度结果图(其中1
‑
8分别是1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl的O1群霍乱弧菌DNA浓度的样品和H2O)；
[0039]图6为LAMP检测重现性结果图(其中，编号1
‑
4：O1群霍乱弧菌；5
‑
8：O139群霍乱弧菌)。
具体实施方式
[0040]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对
本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。此外，下面所描述的本专利技术各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[004本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测O1群霍乱弧菌的引物，其特征在于，包括：上游外引物F3：5
’‑
CATTACCATTATCCATGGCC
‑3’
，SEQ ID NO：1；下游外引物B3：5
’‑
GGCAAGTGGAATTATTTTTACCTTA
‑3’
，SEQ ID NO：2；上游内引物FIP：5
’‑
AGCACTTTTGACGAATAATATCGGAGACTTTCTCTCTTTATTTGGCTC
‑3’
，SEQ ID NO：3；下游内引物BIP：5
’‑
TGCCTGAATTTACAGGCTTACGCGATCGCCAACCCAAGTTGG
‑3’
，SEQ ID NO：4；反向环引物LB：5
’‑
ATCACCACAATATGCACACACA
‑3’
，SEQ ID NO：5。2.根据权利要求1所述的一种用于检测O1群霍乱弧菌的引物，其特征在于，所述上游外引物F3和下游外引物B3用于识别O1群霍乱弧菌特异性检测基因的靶序列。3.根据权利要求2所述的一种用于检测O1群霍乱弧菌的引物，其特征在于，所述上游内引物FIP、下游内引物BIP和反向环引物LB用于扩增O1群霍乱弧菌特异性检测基因的靶序列。4.一种用于检测O1群霍乱弧菌的试剂盒，其特征在于，包括：引物混合液，所述引物混合液包括权利要求1
‑
3中任一项所述的引物。5.根据权利要求4所述的一种用于检测O1群霍乱弧菌的试剂盒，其特征在于，还包括：反应混合...

【专利技术属性】
技术研发人员：周水茂，贾西帅，
申请(专利权)人：武汉市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：