重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体、宿主菌及其制备方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，尤其涉及一种重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体、宿主菌及其制备方法。所述表达载体包括用于编码重组猫血清淀粉样蛋白A的基因序列，所述重组猫血清淀粉样蛋白A包括从N端到C端依次连接的谷胱甘肽巯基转移酶标签、凝血酶酶切位点、组氨酸标签和成熟猫血清淀粉样蛋白A。本发明专利技术以猫SAA前体蛋白第19至219位氨基酸作为表达位点，通过GST标签增强重组蛋白的可溶性及表达量，通过添加酶切位点去除GST标签以还原SAA蛋白在基体内的折叠结构，并利用组氨酸标签实现分离纯化，可以大量有效获取高活性、高纯度的猫SAA蛋白，为开发特异性抗体提供了保证。为开发特异性抗体提供了保证。为开发特异性抗体提供了保证。

【技术实现步骤摘要】
重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体、宿主菌及其制备方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体、宿主菌及其制备方法。

技术介绍

[0002]血清淀粉样蛋白A(Serum amyloid A，SAA)是机体受到感染和损伤时分泌的一种急性期反应蛋白(APP)，主要由肝脏产生。机体正常血清中SAA以恒量存在，但在炎症或感染急性期的48
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72h内SAA可增加数百至上千倍，尤其是病毒性疾病，SAA上升非常明显，并且在疾病的恢复期内迅速下降，是一种灵敏的炎症诊断指标和预后标志物，有利于诊断感染性疾病和炎症性疾病，且诊断结果不受外界因素的干扰，相对更加稳定和精确。在猫出现多种炎症性疾病或传染性疾病如支原体、病毒感染的时候，SAA能最快速产生应答，因而是猫最有效的炎症标志物，在临床上检测猫血清中的SAA含量具有很高的诊断价值。
[0003]鉴于血清淀粉样蛋白A在临床治疗及诊断中的重要性，SAA蛋白的相关研究越来越受到重视。目前，在市场上人SAA检测试剂盒已经商业化，但国产化的猫SAA检测试剂盒还较为空缺，虽然不同物种中，SAA蛋白存在一定同源性，但在检测的实际应用中仍存在一定差异，需要进行技术改进。大肠杆菌作为优良的基因工程表达宿主菌，具有生长周期短、生产成本低、转化率高并且可以高表达目的蛋白等优点，使的大肠杆菌表达系统广泛应用于体外表达SAA重组蛋白，目前普遍采用在SAA的一端添加组氨酸标签，来实现SAA的表达与纯化，但是SAA为高疏水性蛋白，容易体外聚集，而且表达量低，导致表达获得的蛋白生物活性较低，并且活性不稳定，这些缺点极大地限制了现有SAA表达系统的应用。因此，优化血清淀粉样蛋白A的表达方法，提高其表达量和生物活性是当前急需解决的问题。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体、宿主菌及其制备方法，以解决现有技术中血清淀粉样蛋白A表达量和/或生物活性低的技术问题。
[0005]本专利技术具体通过以下技术方案实现：
[0006]本专利技术的第一方面提供了一种重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体，所述表达载体包括用于编码重组猫血清淀粉样蛋白A的基因序列，所述重组猫血清淀粉样蛋白A包括从N端到C端依次连接的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签、凝血酶酶切位点、组氨酸标签和成熟猫血清淀粉样蛋白A(SAA)。
[0007]进一步地，所述重组猫血清淀粉样蛋白A还包括烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)酶切位点，所述烟草蚀纹病毒蛋白酶酶切位点位于所述组氨酸标签和所述成熟猫血清淀粉样蛋白A之间，所述重组猫血清淀粉样蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0008]进一步地，用于编码重组猫血清淀粉样蛋白A的基因序列如SEQ ID NO：2所示。
[0009]进一步地，所述表达载体的出发载体为pGEX
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4T
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1。
[0010]本专利技术的第二方面提供了一种宿主菌，所述宿主菌携带如上所述的表达载体。
[0011]进一步地，所述宿主菌包括大肠杆菌。
[0012]本专利技术的第三方面提供了一种重组猫血清淀粉样蛋白A的制备方法，包括以下步骤：
[0013]S1、将如上所述的表达载体导入大肠杆菌中，诱导培养转化后的所述大肠杆菌，得发酵液；
[0014]S2、将所述发酵液离心后收集菌体，之后使菌体细胞裂解并收集细胞沉淀，用洗涤液洗涤所述细胞沉淀，得到含有重组猫血清淀粉样蛋白A的洗涤液；
[0015]S3、利用凝血酶处理所述洗涤液，亲和层析纯化，收集洗脱液，透析后得到酶切切除谷胱甘肽巯基转移酶标签的所述重组猫血清淀粉样蛋白A。
[0016]进一步地，步骤S1中，诱导培养转化后的所述大肠杆菌包括以下步骤：将活化后的菌液加入到添加氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中，培养至OD
600
达到0.5
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0.55时，加入0.8mM IPTG，置于16℃培养16h。
[0017]进一步地，步骤S2中，使菌体细胞裂解并收集细胞沉淀包括以下步骤：加入破菌液A进行超声破碎，离心收集细胞沉淀，之后加入破菌液B重悬，再次进行超声破碎，离心收集细胞沉淀；该细胞沉淀用于后续分离重组猫血清淀粉样蛋白A；其中，所述破菌液A包括：50mM Tris
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HCl(pH 8.0)、0.1mM EDTA、5％甘油、0.1mM DTT和0.1M NaCl；所述破菌液B包括2M尿素和PBS。
[0018]进一步地，步骤S2中，用洗涤液洗涤所述细胞沉淀包括以下步骤：用所述洗涤液重悬所述细胞沉淀，超声破碎，得到含有所述重组猫血清淀粉样蛋白A的洗涤液和包涵体；其中，所述洗涤液包括：50mM Tris
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HCl(pH 8.0)、0.1mM EDTA、5％甘油、0.1mM DTT、0.1M NaCl和1％ Triton X
‑
100。
[0019]进一步地，步骤S3中，利用凝血酶处理所述洗涤液包括以下步骤：将所述凝血酶加入到所述洗涤液中，所述凝血酶与所述洗涤液中蛋白的质量比为1：100
‑
500，30℃酶切16h。
[0020]本专利技术的优点及积极效果为：
[0021]本专利技术以猫SAA前体蛋白第19至219位共111个氨基酸作为表达位点，在其N端依次添加GST标签、凝血酶酶切位点和组氨酸标签，由于猫SAA蛋白疏水性较强，通过GST标签的高度可溶性可增强重组蛋白的可溶性及表达量，通过添加酶切位点利用酶切法去除GST标签，最大可能性地还原SAA蛋白在基体内的折叠结构，保持其有效的生物活性，并利用组氨酸标签实现高活性重组猫SAA蛋白的分离纯化；由此，表达载体中猫SAA蛋白以融合蛋白的形式进行原核表达时，在宿主菌内的表达含量高，并通过亲和纯化大量有效获取高活性、高纯度的猫SAA蛋白，为开发特异性抗体提供了保证，继而为开发猫SAA商业化检测试剂盒奠定了基础。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0023]图1为本专利技术实施例1构建表达载体时PCR扩增成熟猫SAA基因的琼脂糖凝胶电泳图；
[0024]图2为本专利技术实施例1菌落PCR鉴定表达载体转化阳性克隆的琼脂糖凝胶电泳图；
[0025]图3为本专利技术实施例1诱导表达重组蛋白的SDS
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PAGE凝胶电泳图；
[0026]图4为本专利技术实施例1诱导表达重组蛋白的破细胞上清和包涵体的SDS
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PAGE凝胶电泳图；
[0027]图5为本专利技术实施例1采用TEV酶切重组蛋白的SDS
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括用于编码重组猫血清淀粉样蛋白A的基因序列，所述重组猫血清淀粉样蛋白A包括从N端到C端依次连接的谷胱甘肽巯基转移酶标签、凝血酶酶切位点、组氨酸标签和成熟猫血清淀粉样蛋白A。2.根据权利要求1所述的重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体，其特征在于，所述重组猫血清淀粉样蛋白A还包括烟草蚀纹病毒蛋白酶酶切位点，所述烟草蚀纹病毒蛋白酶酶切位点位于所述组氨酸标签和所述成熟猫血清淀粉样蛋白A之间，所述重组猫血清淀粉样蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。3.根据权利要求2所述的重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体，其特征在于，用于编码重组猫血清淀粉样蛋白A的基因序列如SEQ ID NO：2所示。4.根据权利要求1所述的重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体，其特征在于，所述表达载体的出发载体为pGEX
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4T
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1。5.一种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌携带如权利要求1
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4任一项所述的重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体。6.根据权利要求5所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包括大肠杆菌。7.一种重组猫血清淀粉样蛋白A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将如权利要求1
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4任一项所述的重组猫血清淀粉样蛋白A的表达载体导入大肠杆菌中，诱导培养转化后的所述大肠杆菌，得发酵液；S2、将所述发酵液离心后收集菌体，之后使菌体细胞裂解并收集...

【专利技术属性】
技术研发人员：余乐，李威，盛鑫龙，
申请(专利权)人：优睿赛思武汉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：