一种大肠杆菌有氧发酵生产丁二酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种大肠杆菌有氧发酵生产丁二酸的方法，属于生物工程领域。本发明专利技术在大肠杆菌BL21(DE3)中连续敲除sdhA,iclR,icd,poxB和ptsG，并在该工程菌中组成型过表达gltA

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌有氧发酵生产丁二酸的方法


[0001]本专利技术涉及一种大肠杆菌有氧发酵生产丁二酸的方法，属于生物工程


技术介绍

[0002]丁二酸又称琥珀酸，分子量为118.088，是一种无色晶体，是生物体内三羧酸循环过程中的重要代谢中间产物，也是一种重要的C4平台化合物，常用于合成通用化学品的起始原料，如1,4
‑
丁二醇、四氢呋喃、丁二腈、丁二酸酐和2
‑
吡咯烷酮等，因此被广泛应用于食品、医药、农业领域。此外，丁二酸作为重要的有机合成中间体，广泛应用于合成多种可降解聚酯，如聚丁二酸丁二醇酯(PBS)和聚丁二酸己二醇酯(PHS)等。PBS与其他生物可降解塑料相比不仅力学性能十分优异，且价格十分合理，市场需求量大，全球多个国家和地区开始实施“禁塑、限塑”政策，生物可降解材料迎来较好的发展机遇，专家估计未来我国PBS年需求量将达到300万吨以上，按生产1吨PBS需要0.62吨丁二酸计算，一年需要消耗丁二酸180万吨，而从全球丁二酸产能数据来看，2021年我国丁二酸产能约5.5万吨，全球占比48％，受限于工艺技术和成本等问题，目前丁二酸市场规模仍较低，产能远远达不到市场需求。
[0003]随着代谢工程和合成生物学的快速发展，使用污染小、成本低、可持续的生物法生产丁二酸受到研究者的广泛关注，大肠杆菌因其遗传背景清晰、易于改造、易于培养及利用碳源等诸多优点被选作最有潜力的丁二酸生产菌株，在有氧情况下，细胞能快速生长，并积累大量菌体，但是有氧情况下不能积累丁二酸，且添加大量葡萄糖发酵易发生乙酸溢流。因此，在添加底物葡萄糖的情况下，使大肠杆菌在快速生长的同时积累丁二酸，并减少副产物乙酸的积累是目前亟需解决的技术问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术通过代谢工程改造在大肠杆菌BL21(DE3)中连续敲除sdhA,sdhB,iclR,icd,poxB,ptsG基因中的一个或是多个，并以pCDFDuet
‑
1为表达载体组成型过表达来源于大肠杆菌的柠檬酸合酶基因(gltA)和异柠檬裂解酶基因(aceA)，使大肠杆菌在有氧条件下能大量积累丁二酸，并降低副产物乙酸的含量。
[0005]本专利技术的第一个目的是构建有氧生产丁二酸的大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌在大肠杆菌中敲除琥珀酸脱氢酶基因sdhA、转录因子基因iclR、异柠檬酸脱氢酶基因icd、丙酮酸脱氢酶基因poxB、丙酮酸脱氢酶基因ptsG，并过表达柠檬酸合酶基因gltA与异柠檬裂解酶基因aceA。
[0006]本专利技术还提供了构建所述大肠杆菌工程菌的方法，包括如下至少一个步骤：
[0007](1)通过CRISPR/CAS9的方法在大肠杆菌BL21(DE3)中敲除如SEQ ID NO.1所示基因sdhA(琥珀酸脱氢酶)，所得缺失sdhA基因的大肠杆菌工程菌BL21(DE3)
△
sdhA命名为B1。
[0008](2)通过CRISPR/CAS9的方法在大肠杆菌BL21(DE3)
△
sdhA中敲除如SEQ ID NO.2所示基因sdhB(琥珀酸脱氢酶)，所得缺失sdhB基因的大肠杆菌工程菌BL21(DE3)
△
sdhA
△
sdhB命名为B2。
[0009](3)通过CRISPR/CAS9的方法在大肠杆菌BL21(DE3)
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sdhA中敲除如SEQ ID NO.3所示基因iclR(转录因子)，所得缺失iclR基因的大肠杆菌工程菌BL21(DE3)
△
sdhA
△
iclR命名为B3。
[0010](4)通过CRISPR/CAS9的方法在大肠杆菌BL21(DE3)
△
sdhA
△
iclR中敲除如SEQ ID NO.4所示基因icd(异柠檬酸脱氢酶)，所得缺失icd基因的大肠杆菌工程菌BL21(DE3)
△
sdhA
△
iclR
△
icd命名为B4。
[0011](5)通过CRISPR/CAS9的方法在大肠杆菌BL21(DE3)
△
sdhA
△
iclR
△
icd中敲除如SEQ ID NO.5所示基因poxB(丙酮酸脱氢酶)，所得缺失poxB基因的大肠杆菌工程菌BL21(DE3)
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sdhA
△
iclR
△
icd
△
poxB命名为B5。
[0012](6)通过CRISPR/CAS9的方法在大肠杆菌BL21(DE3)
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sdhA
△
iclR
△
icd
△
poxB中敲除如SEQ ID NO.6所示基因ptsG(磷酸转移酶系统Ⅱ)，所得缺失poxB基因的大肠杆菌工程菌BL21(DE3)
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sdhA
△
iclR
△
icd
△
poxB
△
ptsG命名为B6。
[0013](7)构建加强乙醛酸途径质粒pJUN
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gltA,pJUN
‑
aceA,pJUN
‑
gltA
‑
aceA：以pCDFDuet
‑
1为质粒骨架，以SEQ ID NO.9所示组成型启动子PUTRinfc
‑
rplt分别表达SEQ ID NO.7所示gltA,SEQ ID NO.8所示aceA和gltA
‑
aceA，质粒图谱如图1所示。将质粒pJUN
‑
gltA、pJUN
‑
aceA和pJUN
‑
gltA
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aceA分别转化至大肠杆菌工程菌B6中，所得菌株分别命名为B6
‑
gltA,B6
‑
aceA和B6
‑
gltA
‑
aceA。
[0014]本专利技术的第二个目的是提供用所构建的大肠杆菌工程菌有氧发酵生产丁二酸的方法。
[0015]将大肠杆菌工程菌置于30
‑
40℃下培养10
‑
24h，按照1
‑
3％的接种量转入装有50mL M9改良培养基的250mL三角瓶中，置于30
‑
40℃，转速200
‑
250r/min，摇瓶发酵生产丁二酸。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述的M9改良培养基按g/L计，含有：Na2HPO
4 6～8，KH2PO
4 2～4，NH4Cl 0.5～1.5，NaCl 0.5～1，MgSO
4 0.15～0.3，CaCl
2 0.1～0.2，胰蛋白胨7～8，酵母粉2～3，葡萄糖8～9。
[0017]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种副产物减少的生产丁二酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌在大肠杆菌中敲除琥珀酸脱氢酶基因sdhA、转录因子基因iclR、异柠檬酸脱氢酶基因icd、丙酮酸脱氢酶基因poxB、丙酮酸脱氢酶基因ptsG，并过表达柠檬酸合酶基因gltA与异柠檬裂解酶基因aceA。2.根据权利要求1所述大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述琥珀酸脱氢酶基因sdhA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述转录因子基因iclR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述异柠檬酸脱氢酶基因icd的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述丙酮酸脱氢酶基因poxB的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述丙酮酸脱氢酶基因ptsG的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述柠檬酸合酶基因gltA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述异柠檬裂解酶基因aceA的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。3.根据权利要求2所述大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌的宿主为大肠杆菌BL21(DE3)或MG1655。4.根据权利要求1
‑
3任一所述大肠杆菌工程菌，其特征在于，将SEQ ID NO.9所示组成型启动子PUTRinfc
‑
rplt与所述柠檬酸合酶基因gltA和异柠檬裂解酶基因aceA连接到载体pCDFDuet
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1上。5.一种构建权利要求4所述大肠杆菌工程菌的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓禹，周胜虎，杨海宁，李国辉，毛银，赵运英，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：