一种铅镉修复植物华中蹄盖蕨的孢子繁殖方法技术

一种铅镉修复植物华中蹄盖蕨的孢子繁殖方法。该方法建立了包括孢子采收与贮存、外植体消毒与接种、孢子萌发、配子体增殖培养、孢子体诱导培养、孢子苗移栽与管理等步骤的完整孢子快速繁殖体系。其中，配子体增殖培养基经优化后，在不发生分化的前提下实现了绿色球状体的高效增殖，一个月即可增殖7.3

【技术实现步骤摘要】
一种铅镉修复植物华中蹄盖蕨的孢子繁殖方法


[0001]本专利技术属于植物
，具体涉及一种铅镉修复植物华中蹄盖蕨(Athyrium wardii(Hook.)Makino)孢子快速繁殖方法。

技术介绍

[0002]我国矿区土壤养分贫瘠、物理结构差、重金属含量极高且易迁移，以镉、铅污染最为严重，对矿区附近生态环境、食品安全和居民健康构成严重威胁。矿区土壤重金属污染治理与生态恢复仍然是我国贯彻《土壤污染防治法》、实施《土壤污染防治行动计划》和生态文明建设的重大战略需求。植物稳定修复技术利用重金属耐性植物，通过根系积累、根际沉淀等方式将重金属固定在植物根际，降低重金属有效性和迁移性，经济高效且环境友好，在矿区重金属固定及植被恢复方面具有较强的可操作性。华中蹄盖蕨是一种发现于我国川西典型铅锌矿区的铅镉积累植物，为多年生蕨类，喜阴，根系发达，可用于矿区镉铅污染土壤的植物稳定修复(Zou et al.,J.Hazard.Mater.,2011；Zhang et al.,Environ.Sci.Pollut.R.,2012；Zhan et al.,Ecotox.Environ.Safe.,2018；Zhan et al.,Environ.Pollut.,2020)。目前，受限于育苗技术，华中蹄盖蕨相关基础研究和应用研究难以开展。开展华中蹄盖蕨孢子繁殖技术研究，优化“绿色球状体(GGB)增殖培养”和“孢子体诱导培养”等关键技术步骤，建立华中蹄盖蕨快繁技术体系，增强华中蹄盖蕨环境适应性，可为其相关基础研究以及规模化应用奠定技术基础，对矿区重金属污染土壤修复及植被恢复具有重要意义。

技术实现思路

[0003]解决的技术问题：克服某些蕨类植物(如华中蹄盖蕨)在无菌培养基中难以形成或不能形成幼孢子体，以及原叶体发育到幼孢子体形成这一过程存在的效率低、耗时长等技术问题。
[0004]技术方案：一种铅镉修复植物华中蹄盖蕨的孢子繁殖方法，将消毒过的孢子接种于孢子萌发培养基，4
‑
8周萌发，28
‑
31天后，原叶体长到不低于0.5cm，逐渐形成绿色球状体GGB；将GGB切1cm3小块，接种于GGB增殖培养基上培养一个月；增殖培养的GGB，切分成1cm3小块，采用如下1)
‑
2)任一步骤诱导孢子体：1)转接孢子体诱导培养基进行无菌培养，诱导分化过程中，采用孢子体继代培养基培养，每两周继代一次，2
‑
3个月后开始长出幼孢子体；2)移栽于草炭土/泥炭土基质上，置于自然条件下培养，2
‑
3个月后开始长出幼孢子体，待幼孢子体长至1
‑
5cm即可移栽、炼苗。
[0005]优选的，上述孢子萌发培养基为：MS+30g/L蔗糖+8.5g/L琼脂+1mg/L GA3；GGB增殖培养基为：1/2MS+30g/L蔗糖+8.0g/L琼脂；孢子体诱导培养基为：MS+30g/L蔗糖+8.5g/L琼脂+0.5mg/L 6
‑
BA+0.5mg/L NAA；孢子体继代培养基为：MS+30g/L蔗糖+8.5g/L琼脂+0.5mg/L 6
‑
BA+0.5mg/L NAA，pH均为5.80
‑
5.90。
[0006]优选的，上述草炭土/泥炭土基质的有机质含量不低于50wt.％，颜色呈深褐色至
黑色，粒径≤6mm。
[0007]优选的，上述移栽时保持盆土湿度≥95％，喷施1/8MS营养液，维持空气湿度50％
‑
70％。
[0008]优选的，上述孢子繁殖过程培养条件为：温度保持在22
‑
25℃；光源采用16W植物补光灯，每天光照16h，光照度为1500lux。
[0009]有益效果：(1)本专利技术提供的“GGB增殖培养”优化技术，有效提高了GGB的诱导率和增殖速率，一个月即可增殖7.3
‑
10.2倍，且GGB诱导率达100％，增殖效果优于现有绝大多数孢子繁殖方法。(2)成功构建了基于完全组织培养和不完全组织培养的孢子快速繁殖技术体系，获得大量GGB和孢子体，推进了华中蹄盖蕨快繁体系的建成和产业化培养，可为华中蹄盖蕨应用于矿区重金属污染土壤修复及植被恢复提供大量种苗；同时，本专利技术提供的方法所获得的华中蹄盖蕨GGB也可作为种质资源保存。
附图说明
[0010]图1为实施案例1、2孢子繁殖情况，图a为原叶体发育情况，图b为含MS分化培养基诱导的孢子体(无菌体系)，图c、d分别为自然条件和无菌体系下GGB移栽于优质草炭土/泥炭土基质后诱导孢子体的情况。
具体实施方式
[0011]实施例1：
[0012]组织培养法，详细步骤如下：
[0013](1)孢子的采收与贮存：于夏、秋季节采集成熟的孢子。当孢子囊呈棕褐色时，即为孢子成熟，直接将枝叶剪下，自然风干后，轻轻抖落孢子，装入硫酸纸袋中。采集的新鲜孢子，宜及时播种，萌发率高；不能及时播种的孢子应冷藏保存于2
‑
8℃冰箱，以延长孢子的寿命。
[0014](2)外植体的消毒：采集的外植体孢子，取75％酒精加吐温20消毒20s，用无菌水清洗3次后用无菌滤纸吸干，再用1％次氯酸钠溶液加吐温20浸泡3min，经无菌水漂洗3遍后用无菌滤纸吸干，备用。
[0015](3)外植体的接种：经消毒后的孢子，用无菌水制成悬浮液，然后用无菌移液枪吸取200μL滴加于装有孢子萌发培养基的培养瓶中，轻微摇动培养瓶，使孢子均匀分布在培养基上进行培养。孢子萌发的培养时间约为4
‑
8周。孢子萌发培养基配方为：MS+30g/L蔗糖+8.5g/L琼脂+1mg/L GA3(pH 5.80
‑
5.90)，制成的培养基分装到200mL培养瓶中，每瓶约加入培养基20
‑
30mL，室温冷却后待用。
[0016](4)配子体增殖培养：孢子萌发后，会产生大量原叶体，约1个月后，原叶体长到0.5cm以上，逐步形成GGB(图1：a)。将GGB切小块(1cm3左右)，接种于含不同盐浓度、不同蔗糖浓度和不同激素浓度的增殖培养基进行增殖培养，增殖培养基配方见表1，pH均为5.80
‑
5.90，制成的培养基分装到200mL培养瓶中，每瓶约加入培养基20
‑
30mL，室温冷却后待用。培养1个月，观察GGB长势，各培养基增殖培养效果见表1。其中，增殖培养基
⑩“
1/2MS+30g/L蔗糖+8.0g/L琼脂”诱导GGB所花时间更短，GGB颜色更为翠绿，GGB诱导率最高、增殖倍数最大，综合效果最好。增殖培养的GGB，可切分成小块(1cm3左右)，转接到增殖培养基
⑩
上继续
增殖。
[0017](5)孢子体诱导培养：步骤(4)中所述增殖培养的GGB，可切分成小块(1cm3左右)，转接孢子体诱导培养基培养，诱导分化过程中，每两周继代一次，诱导分化形成孢子本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种铅镉修复植物华中蹄盖蕨的孢子繁殖方法，其特征在于，将消毒过的孢子接种于孢子萌发培养基，4
‑
8周萌发，28
‑
31天后，原叶体长到不低于0.5 cm，逐渐形成绿色球状体GGB；将GGB切1 cm3小块，接种于GGB增殖培养基上培养一个月；增殖培养的GGB，切分成1 cm3小块，采用如下1）
‑
2）任一步骤诱导孢子体：1）转接孢子体诱导培养基进行无菌培养，诱导分化过程中，采用孢子体继代培养基培养，每两周继代一次，2
‑
3个月后开始长出幼孢子体；2）移栽于草炭土/泥炭土基质上，置于自然条件下培养，2
‑
3个月后开始长出幼孢子体，待幼孢子体长至1
‑
5 cm即可移栽、炼苗。2.根据权利要求1所述铅镉修复植物华中蹄盖蕨的孢子繁殖方法，其特征在于，所述孢子萌发培养基为：MS+30 g/L蔗糖+8.5 g/L琼脂+1 mg/L GA3；GGB增殖培养基为： 1/2 MS +30 g/L蔗糖+8....

【专利技术属性】
技术研发人员：詹娟，吴龙华，徐文忠，李廷轩，严颖，张艺馨，
申请(专利权)人：中国科学院南京土壤研究所，
类型：发明
国别省市：