基于LAMP-CRISPR/Cas12a系统沙门氏菌的快速检测方法技术方案

本发明专利技术提供一种基于LAMP

【技术实现步骤摘要】
基于LAMP
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CRISPR/Cas12a系统沙门氏菌的快速检测方法


[0001]本专利技术涉及病原微生物检测
，具体涉及基于LAMP
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CRISPR/Cas12a系统沙门氏菌的快速检测方法。

技术介绍

[0002]沙门氏菌是一种主要的食源性致病菌。人们误食了沙门氏菌污染的食物之后，会引起腹泻、呕吐、头晕、高烧等症状，不但表现为急性肠胃炎，还有全身感染的症状，使人体免疫力下降，出现反复感染。同时，沙门氏菌还可以引起畜禽发病，沙门氏菌还可污染畜禽制品引起人类中毒和一系列疾病。沙门氏菌作为一种危害非常大的食源性细菌，它的检测结果已经成为了食品安全检测是否合格的一个重要指标。因此，为了保证食品安全和畜牧业的高效生产，建立一种快速、准确、高效的检测沙门氏菌的方法十分有必要。
[0003]现如今常用的有qPCR检测沙门氏菌，利用荧光信号对PCR进程进行实时监测，最后，通过标准曲线对未知模板进行定量分析。还有恒温隔绝式PCR技术(Insulated isothermal PCR，iiPCR)，基于瑞利
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贝纳尔(Rayleigh
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Benard)的对流原理，通过反应管底部液体不断加热，上下液体产生温度差，控制散热的速率与对流的时间，在反应管中形成稳定温度梯度，从而提供PCR扩增所需的反应条件。Awang等人利用电化学传感检测沙门氏菌。该系统采用免疫技术、分子技术、质谱法、光谱法、光学表型法和生物传感器方法等结合而成。这些研究方法虽然提高了检测率，但是耗时长，成本高，并且要求必备精密仪器，不能得到真正的普及，不适于应对紧急情况。
[0004]LAMP由日本学者Notomi专利技术，在具有DNA聚合酶的作用下，用4
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6对引物，在60
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65℃下扩增目的基因，随后在琼脂糖凝胶电泳下检验扩增结果。它与传统PCR相比，反应速率快，在45
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60min就可完成。该方法成本低廉且使用方便，不需要专门的技术人员和昂贵的仪器就可以完成操作。该方法检测灵敏度高，同普通PCR相比，灵敏度可提高10000倍。以LAMP反应为基础研究的最新技术——循环介质等热放大，通过使用DNA聚合酶，在等温条件下，高特异性、高效率的扩增DNA。适用于应对突发情况的现场检测。通常情况下，LAMP扩增产物的检测方法包括琼脂糖凝胶电泳、浊度检测法、颜色判定法。颜色判定法。常用的显色剂有两大类：金属离子指示剂(钙黄绿素、羟基萘酚蓝以及二者组合等)和核酸染料指示剂(SYBR GreenⅠ、GeneFinder和碘化丙啶等)。在检测现场的条件有限，不依赖昂贵仪器或者不需要任何仪器是最理想的。同时，裸眼即可以对结果进行准确判定。但LAMP的引物设计、体系所加引物的量、反应温度、反应时间、酶、缓冲液等任一因素不在最优条件都有可能导致假阳性的产生，而上述方法无法排除假阳性的存在，对检测结果的准确性造成不利影响。
[0005]CRISPR/Cas系统是细菌在进化中为了抵御外源质粒转移与噬菌体入侵而形成的一种获得性免疫系统。科学家张锋在2015年发现了一种CRISPR效应蛋白Cas12a。该蛋白是一种由RNA指导的DNA切割核酸酶，在与靶DNA结合后，它可以顺式切割靶标DNA，并反式切割非靶标单链DNA。该系统具有高度敏感性和特异性，被广泛应用于双链或单链DNA的检测。基于CRISPR/Cas12a的平台可用于快速和可视化核酸检测，被广泛应用于核酸分子诊断领域。
CRISPR/Cas12a系统可以检测病原微生物的存在。比如，沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌等。将各种病原菌DNA稀释十倍后进行PCR扩增，反应产物作为目标物用于Cas12a荧光检测体系，结果显示，检测灵敏度最高可以达到10拷贝/微升，并且每种引物和DNA只能特异性参与目标细菌的检测反应。CRISPR/Cas12a系统自身检测灵敏度受限，通常情况下，需要结合核酸放大器，PCR或者等温扩增技术。LAMP的灵敏度非常高，与CRISPR/Cas12a系统相结合，可以提高CRISPR/Cas12a系统的检测灵敏度；另外，Cas12a酶切的二次检测，可以排除LAMP的假阳性问题；两种方法相结合，可以很好实现沙门氏菌检测的高灵敏度和高特异性。

技术实现思路

[0006](一)解决的技术问题
[0007]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种基于LAMP结合CRISPR/Cas12a系统高效、快速、适用于现场的检测沙门氏菌的新方法。
[0008](二)技术方案
[0009]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：
[0010]本专利技术提供了一种基于LAMP
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CRISPR/Cas12a系统沙门氏菌的快速检测方法，所述方法包括以下步骤：
[0011](1)提取待测样品的基因组DNA；
[0012](2)设计sgRNA和包含sgRNA的PCR引物，采用PCR结合Cas12a酶切方法筛选得到目标sgRNA；
[0013](3)设计LAMP引物，以步骤(1)提取的基因组DNA作为模板，进行LAMP扩增；
[0014](4)以步骤(1)提取的基因组DNA作为模板，步骤(2)设计的PCR引物，扩增特异致病基因SpiB，构建至pMD
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19T克隆载体，构建pMD19T
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SpiB质粒；以十倍比例倍比稀释质粒作为LAMP扩增的模板；
[0015](5)荧光可视检测，将LAMP扩增产物、Cas12a、荧光探针、目标sgRNA、NEB Buffer2.1混匀，孵育10～30min，在蓝光或紫外光下裸眼可视对样品中沙门氏菌的定性检测。
[0016]进一步地，所述步骤(1)中样品基因组的提取为热裂解法，无需额外的试剂盒，获取DNA耗时17～27min。
[0017]进一步地，所述步骤(2)中设计的sgRNA，是针对沙门氏菌的致病基因SpiB序列以及PAM序列(TTTN)设计10条sgRNA；sgRNA的核苷酸序列如Sep_1
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10所示，sgRNA通过体外转录和纯化或直接合成获得，sgRNA的获得包括但不限于上述方法。针对包含10条sgRNA的靶标序列，设计PCR引物，PCR结合Cas12a酶切，选定目标sgRNA，目标sgRNA的核苷酸序列如Sep_6所示；PCR的引物的核苷酸序列如Sep_11、12所示。
[0018]进一步地，所述步骤(3)中设计的LAMP引物，LAMP的靶标序列中包含目标sgRNA，其中包括内引物FIP，FIP的核苷酸序列如Sep_13所示；内引物BIP，BIP的核苷酸序列如Sep_14所示；外引物F3，F3的核苷酸序列如Sep_15所示；外引物B3，B3的核苷酸序列如Sep_16所示；环引物LF，LF的核苷酸序列如Sep_17所示；环引物LB，LB的核苷酸序列如Sep_18所示。
[0019]进一步地，所述步本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于LAMP
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CRISPR/Cas12a系统沙门氏菌的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测样品的基因组DNA；(2)设计sgRNA和包含sgRNA的PCR引物，采用PCR结合Cas12a酶切方法筛选得到目标sgRNA；(3)设计LAMP引物，以步骤(1)提取的基因组DNA作为模板，进行LAMP扩增；(4)以步骤(1)提取的基因组DNA作为模板，步骤(2)设计的PCR引物，扩增特异致病基因SpiB，构建至pMD
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19T克隆载体，构建pMD19T
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SpiB质粒；以十倍比例倍比稀释质粒作为LAMP扩增的模板；(5)荧光可视检测，将LAMP扩增产物、Cas12a、荧光探针、目标sgRNA、NEB Buffer2.1混匀，孵育10～30min，在蓝光或紫外光下裸眼可视对样品中沙门氏菌的定性检测。2.根据权利要求1所述的基于LAMP
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CRISPR/Cas12a系统沙门氏菌的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中设计的sgRNA的核苷酸序列如Sep_1
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10所示；包含sgRNA序列的沙门氏菌特异致病基因SpiB基因普通引物的核苷酸序列如Sep_11、12所示，用于普通PCR结合Cas12a酶切筛选得到目标sgRNA。3.根据权利要求1所述的基于LAMP
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CRISPR/Cas12a系统沙门氏菌的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中设计的LAMP引物，LAMP的靶标序列中包含目标sgRNA，其中包括内引物FIP，FIP的核苷酸序列如Sep_13所示；内引物BIP，BIP的核苷酸序列如Sep_14所示；外引物F3，F3的核苷酸序列如Sep_15所示；外引物B3，B3的核苷酸序列如Sep_16所示；环引物LF，LF的核苷酸序列如Sep_17所示；环引物LB，LB的核苷酸序列如Sep_18所示。4.根据权利要求1所述的基于LAMP
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CRISPR/Cas12a系统沙门氏菌的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中设计的LAMP的扩增体系为25μL体系，包括4.4
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【专利技术属性】
技术研发人员：李聪聪，牛丽珠，刘昆，霍永，吴姣，徐永杰，王昊鹏，姜东凤，李婉涛，徐秋良，陶大刚，谢胜松，
申请(专利权)人：河南牧业经济学院，
类型：发明
国别省市：