纳米颗粒探针及其在核酸检测中的用途制造技术

本发明专利技术提供了一种使用寡核苷酸探针功能化的纳米颗粒检测样品中靶向核酸分析物(例如，病原体或病毒核酸)存在情况的方法，其中至少三种不同的寡核苷酸探针与靶向分析物中至少三种不同的靶向序列的杂交引起纳米颗粒的聚集和看得见的颜色变化。本发明专利技术还提供了这样的寡核苷酸探针功能化的纳米颗粒群以及和用于检测靶向核酸分析物的相关试剂盒。于检测靶向核酸分析物的相关试剂盒。于检测靶向核酸分析物的相关试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】纳米颗粒探针及其在核酸检测中的用途
[0001]本申请要求2020年6月9日提交的EP20382499.0的优先权，其内容和要素出于所有目的通过引用并入本文。


[0002]本专利技术涉及靶向核酸的检测，特别是微生物或病毒如幽门螺旋杆菌，SARS
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2或丙肝病毒的核酸的检测。

技术介绍

[0003]COVID
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19
[0004]COVID
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19是由冠状病毒严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS
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2)引起的严重呼吸系统疾病。
[0005]成功控制新出现的流行病或世界流行病的关键是识别和隔离有症状或无症状的感染者。随着世界流行病的发展和确立，为了确保社会的持续运转，需要通过开发和随后检测针对疾病的特异性抗体，将已经感染但可能因轻微、混乱或无症状而不知道的个体确定为已产生免疫力的个体。在缺乏有效疫苗或治疗方法的情况下，检验处在感染控制的第一线。
[0006]目前存在三种主要类型的SARS
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2检验(抗原、抗体和基因)，它们具有非常不同的特性、优点和缺点。抗原检验对病毒的部分(通常是蛋白质)进行检测，是目前最常用的快速检验形式。然而，由于与其他相关蛋白的交叉反应，这些检验往往不如基因检验准确。抗体检验也是对针对病毒的抗体(IgG或IgM)存在情况进行检测的快速检验，并且通常比抗原检验更具特异性，但不能在患者最具传染性时将患者检测出，因为抗体直到感染后10～14天才出现在人体中。病毒检验的黄金标准仍然是检测病毒特异性核酸(RNA)序列的基因检验。目前，市场上所有的基因检验都是基于PCR的。即使对该技术的检测周转时间进行了逐步改进，基于PCR的检验在其可扩展性方面也受到限制，因为它们需要专门的实验室、昂贵的设备、试剂和受过训练的人员。
[0007]迫切需要一种可扩展的快速基因检验，无需可随时随地使用的基础设施。本专利技术解决了这些和其它需求，并提供了如本文所述的相关优点。
[0008]检测技术
[0009]使用纳米颗粒的比色传感器已经用于检测多种分析物，包括蛋白质和核酸、有机小分子和金属离子。溶液中的球形金纳米颗粒(AuNP)由于其在～520nm处强烈的局部表面等离子体共振而呈现红色。AuNP的聚集诱导电偶极子
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偶极子相互作用和相邻颗粒的等离子体之间的耦合，导致颜色从粉红色变为蓝色/紫色或透明，对应于表面等离子体带从523nm向610～670nm移动(图1)。
[0010]比色传感器具有许多优点。它们易于使用，通常只涉及单一步骤，不需要受过训练的人员。由于极高的消光系数，它们非常敏感，只需要几个纳米颗粒就能产生可见的颜色变化。此外，既不需要复杂的分析仪器，也不需要昂贵的分析仪器，因为可以用肉眼检测颜色
变化。最近，比色测定被用于检测SARS
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2的部分N基因(参考文献6)。
[0011]然而，由于灵敏度的限制，当前大多数基于单个或两个探针群的检测体系不容易适应，尽管其针对主要污染物的检测足够灵敏，但针对病原体的检测不够灵敏。需要改进的方法用于检测针对病原体诸如SARS
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2的靶向分析物。本专利技术解决了这些和其它需求，并提供了如本文所述的相关优点。

技术实现思路

[0012]本专利技术大体上涉及用于检测样品中靶向核酸的基于纳米颗粒的检测平台。该检测平台基于纳米颗粒依赖于靶向核酸的团聚，其产生看得见的颜色变化。专利技术人惊奇地发现，仔细选择与靶向核酸中的靶向序列互补的寡核苷酸探针序列使得靶向序列间隔开或者连续且不重叠，为检测平台提供足够的灵敏度和特异度，以快速有效地指示样品中是否存在靶向核酸，甚至在没有复杂分析仪器的情况下，例如在某些情况下通过在数小时或数分钟内提供肉眼看得见的反应溶液的清晰颜色变化。这是对现有技术描述的需要固定的载玻片点样、波导和CMOS传感器的检测平台(诸如WO2005/008222中所描述的检测平台)可喜的改进。此外，Moitra等人2020年描述了一种需要RNA酶处理(并因此在升高的温度下孵育)以产生看得见的颜色变化的方法。
[0013]因此，在第一方面，本专利技术提供了一种用于检测样品中靶向核酸分析物存在情况的方法，其中靶向核酸分析物包含至少第一靶向序列、第二靶向序列和第三靶向序列，这些靶向序列是间隔开的或者连续且不重叠的，所述方法包含：提供寡核苷酸探针功能化的纳米颗粒群，该群至少包含与第一靶向序列杂交的第一寡核苷酸探针、与第二靶向序列杂交的第二寡核苷酸探针以及与第三靶向序列杂交的第三寡核苷酸探针；以及使包含样品的溶液与纳米颗粒群接触，其中寡核苷酸探针序列与靶向序列之间的多个特异性结合事件引起纳米颗粒团聚，从而导致溶液产生依赖于靶向核酸分析物的看得见的颜色变化。因此，本专利技术的方法采用检测在“自由浮动”的溶液中接触的纳米颗粒和靶向核酸分析物，而不是如现有技术方法中教导的那样固定在基材上。这大大简化了检测平台的生产和使用，因为简单的管材(例如，由聚丙烯制成的用于制备、混合、离心、运输和存储固体和液体样品以及试剂的一次性管材)可以用于混合纳米颗粒和样品，并且在简单混合或摇动后几分钟或几十分钟内通过肉眼看得见的颜色变化来指示检测结果。
[0014]在一些实施方式中，每种类型的纳米颗粒是利用多个拷贝的一种类型的寡核苷酸探针而功能化的。
[0015]在一些实施方式中，纳米颗粒群包含多种不同类型的纳米颗粒，每种纳米颗粒是利用多个拷贝的至少三种类型的寡核苷酸探针中的任一种而功能化的。
[0016]在一些实施方式中，纳米颗粒群是利用至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、95种或至少100种类型的寡核苷酸探针而功能化的，寡核苷酸探针与靶向分析物中的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、95或至少100种相应的间隔开的或者连续且不重叠的靶向序列杂交。
[0017]在某些实施方式中，纳米颗粒群是利用10种类型的寡核苷酸探针而功能化的，该寡核苷酸探针与靶向分析物中的10种相应的间隔开的或者连续且不重叠靶向序列结合。
[0018]在一些实施方式中，优选寡核苷酸探针中的一种或多种(例如，全部)与其所杂交的靶向序列完全互补。然而，特别考虑的是，与靶向序列杂交的寡核苷酸探针，例如尽管有一个或多个错配(例如，1、2、3、4或5个碱基错配)，也可以在某些实施方式中使用。
[0019]在一些实施方式中，将靶向物与总纳米颗粒的摩尔比选择为允许靶向物特异性的纳米颗粒团聚本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于检测样品中靶向核酸分析物存在情况的方法，其中所述靶向核酸分析物包括至少第一靶向序列、第二靶向序列和第三靶向序列，这些靶向序列是间隔开的或者连续且不重叠的，所述方法包含：a)提供寡核苷酸探针功能化的纳米颗粒群，所述群至少包含与所述第一靶向序列杂交的第一寡核苷酸探针、与所述第二靶向序列杂交的第二寡核苷酸探针以及与所述第三靶向序列杂交地第三寡核苷酸探针；以及b)使包含所述样品的溶液与所述纳米颗粒群接触，其中所述寡核苷酸探针序列与靶向序列之间的多个特异性结合事件引起纳米颗粒团聚，由此引起溶液产生依赖于靶向核酸分析物的看得见的颜色变化。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述纳米颗粒群包含至少三种、至少四种或者至少五种类型的纳米颗粒，其中每种类型的纳米颗粒是利用多个拷贝的一种类型的寡核苷酸探针而功能化的。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述纳米颗粒群包含多种不同类型的纳米颗粒，每一种是利用多个拷贝的至少三种类型的寡核苷酸探针中的任一种而功能化的。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒群是利用至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或至少25种类型的寡核苷酸探针而功能化的，所述寡核苷酸探针与靶向分析物中的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或至少25种相应的间隔开的或者连续且不重叠的靶向序列杂交。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒群是利用与所述靶向分析物中的10种相应的间隔开的或者连续且不重叠的靶向序列结合的10种类型的寡核苷酸探针而功能化的。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸探针中的一个或多个优选与其所杂交的靶向序列互补或者包含一至三个碱基错配。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中靶向物与总纳米颗粒的摩尔比选择为允许靶向特异性的纳米颗粒团聚。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶向物与总纳米颗粒的摩尔比在1至0.001的范围。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包含片段化步骤，在该步骤中将所述靶向核酸分析物断裂成两个或多个片段。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述片段化步骤包含对样品超声处理一段时间。11.根据权利要求10所述的方法，其中超声处理的时间为至少10秒、至少30秒或者至少60秒。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶向分析物包含病毒RNA。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶向分析物包含病毒基因组RNA、病毒亚基因组mRNA或者病毒mRNA。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶向分析物包含SARS
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2RNA。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶向分析物包含SARS
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2的E蛋白和/或N蛋白的基因组序列。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶向分析物包含SARS
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2的E基因和/或N基因的sgmRNA。17.根据权利要求14所述的方法，其中所述探针序列选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。18.根据权利要求14所述的方法，其中所述探针序列选自SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。19.根据权利要求14所述的方法，其中所述探针序列选自SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒具有包含金属或金刚石的核。21.根据权利要求20所述的方法，其中包含金属的所述核包含金或银。22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒是球体、非球体、椭球或双锥体。23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒的直...

【专利技术属性】
技术研发人员：劳里，
申请(专利权)人：上海橙康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：