一种表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡(TF NVs)及其制备方法和应用。所述TF NVs由生物细胞膜构成，细胞膜表面表达转铁蛋白；并进一步制备得到了衍生化的TF NVs，包括载铁纳米囊泡、载药纳米囊泡及载铁与载药联用纳米囊泡。本发明专利技术研究显示，上述纳米囊泡可结合肿瘤细胞中转铁蛋白受体TFRC靶向肿瘤细胞，从而实现纳米囊泡的肿瘤靶向递送。同时能够显著抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞铁死亡；在体内生理环境中，均能抑制小鼠体内肿瘤生长和增殖，并促进肿瘤部位铁离子的积累，通过诱导肿瘤细胞铁死亡从而实现对肿瘤的治疗，可作为新型的药物递送工具或药物制剂，也为癌症治疗提供了一个新思路。症治疗提供了一个新思路。症治疗提供了一个新思路。

【技术实现步骤摘要】
一种表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，更具体地，涉及一种表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]传统的癌症治疗方法包括化疗、放疗和手术，虽然有效，但副作用严重。此外，化疗和放疗的生存效益不足，手术治疗转移性肿瘤无效。因此，开发更有效、毒性更小的治疗方法是非常必要的。与传统疗法相比，癌症免疫疗法是通过激活免疫系统的免疫反应来治疗癌症。增强免疫系统来对抗癌症的方法是由威廉
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科利博士在19世纪末首次提出的。此外，肿瘤内注射微生物毒素引发抗癌作用也是由他首先提出的。此后，癌症免疫治疗的研究蓬勃发展，取得了良好的临床效果，如肿瘤疫苗、免疫检查点封锁和嵌合抗原受体T细胞(CAR
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T)治疗。当前，免疫治疗在各种恶性肿瘤的治疗中取得了良好的效果，在癌症治疗领域发挥着重要的作用。但由于免疫治疗具有明显的复杂性和不确定性，诱导免疫系统过度活跃可能导致严重的不良反应。因此，开发新的治疗方法，克服免疫治疗引起的不良事件具有重要意义。
[0003]细胞死亡是生命体更新换代的必经过程，细胞死亡方式可以包括多种，比如程序性细胞死亡方式(自噬)、细胞凋亡、细胞坏死等，随着科学研究的不断深入，新的细胞死亡方式也浮出水面。2012年，一种新的细胞死亡方式——铁死亡(Ferroptosis)由Dixon等提出，铁死亡是一种依赖铁离子的氧化死亡方式，以过度的氧化应激和膜脂质过氧化反应为主要表现，最终导致质膜破裂，从而造成细胞死亡。随着研究的不断深入，关于铁死亡的调节机制不断在丰富，但经典的两条分子机制还是谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathion peroxidase 4，GPX4)的活性阻断。第一种是通过抑制System Xc
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(胱氨酸/谷氨酸膜上逆转运通道)抑制GPX4的合成；另一种是直接用药物降解或阻断GPX4的活性，这两条机制的最终结果都是膜上脂质过氧化物ROS的积累，产生细胞毒性并破坏膜的完整性，导致细胞死亡。但近些年，随着大量研究的不断深入，研究者们也发现了一些不依赖GPX4通路的分子机制，比如铁死亡抑制蛋白(Ferroptosis
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suppressor
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protein1，FSP1)通路、Keap1
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Nrf2
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ARE信号通路、p53调控机制、PUFAs(多不饱和脂肪酸)转运通路、谷氨酰胺转运通路、转铁蛋白转运通路等等。
[0004]转铁蛋白受体(Transferrin receptor，TFRC，CD71)是表达于快速增殖细胞表面的一种Ⅱ跨膜糖蛋白，由二硫键连接两个相同亚基(95KD)构成，是机体铁代谢、免疫功能和细胞调节的重要因素之一。多项研究表明，TFRC在多种肿瘤细胞(包括肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌等)过表达，TFRC的表达程度与肿瘤分级和分期呈正相关，而且TFRC在HCC组织中表达比正常组织高，与较差的生存率有关，可提示HCC的临床预后。TFRC在肿瘤细胞中过表达的原因主要有三点：1)铁是细胞增殖和能量代谢的重要元素，TFRC是细胞铁代谢所必需的重要蛋白成分，肿瘤细胞高表达TFRC，能够满足肿瘤细胞生长增殖对铁的大量需求；2)TFRC
参与调节癌细胞NF
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κB信号通路，打破细胞增殖与凋亡之间的平衡抑制细胞凋亡，从而提高肿瘤细胞生存率；3)TFRC促进线粒体呼吸，增加ROS产生，诱导DNA损失引发突变，促进肿瘤的发生转移。因此，TFRC被认为是一种有效的肿瘤标志物，能够有效地靶向肿瘤细胞，提高肿瘤治疗的效果。
[0005]同时，TFRC也是细胞铁死亡相关铁摄取受体，是细胞摄取转铁蛋白复合物所必需的，研究表明TFRC基因沉默能够抑制Erastin或其他诱导剂引起的铁死亡。相反地，在生长培养基中添加铁结合的转铁蛋白或生物可利用铁(如柠檬酸铁铵)，而不添加其他二价金属，会加速Erastin诱导的铁死亡。所以，通过TFRC靶向肿瘤细胞诱导铁死亡将会是极具开发潜力的肿瘤治疗新策略。然而目前还缺少可通过结合TFRC靶向肿瘤细胞诱导铁死亡的相关药物递送载体和药物制剂。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡。
[0007]本专利技术的第二个目的在于提供所述表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡的制备方法。
[0008]本专利技术的第三个目的在于提供一种载铁纳米囊泡。
[0009]本专利技术的第四个目的在于提供所述表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡或载铁纳米囊泡作为药物载体在制备肿瘤治疗药物中的应用。
[0010]本专利技术的第五个目的在于提供一种肿瘤靶向药物制剂。
[0011]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
[0012]一种经基因改造膜表面高表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡(TF NVs)，由生物细胞膜构成，细胞膜表面表达转铁蛋白。
[0013]近年来，细胞外囊泡给药被提出作为一种无细胞治疗的策略之一，因其提高免疫治疗的安全性和有效性而受到越来越多的关注。细胞外囊泡是由活细胞产生的异质膜囊泡，是细胞间信息和物质的天然载体。细胞外囊泡广泛存在于血液、尿液、唾液、脑脊液、胸液和母乳中，根据产生方式的不同可分为外泌体、微泡和凋亡小体。同时，细胞外囊泡作为天然载体，在药物传递领域得到了广泛的研究。与其他载药纳米材料不同的是，细胞外囊泡可以直接将载药物质送到细胞质中，优点是生物相容性好，免疫原性低。细胞外囊泡也显示出跨越生理障碍和同源靶向的潜力。此外，细胞外囊泡还具有广泛的生物调节功能，如免疫调节、信号转导等。因为以上的优点细胞外囊泡的使用有望发展出更安全、无细胞的免疫治疗策略。
[0014]而本申请通过基因工程改造，提供了一种膜表面高表达转铁蛋白的纳米囊泡(TF NVs)，所述TF NVs可靶向结合肿瘤细胞内的TFRC，靶向肿瘤细胞诱导铁死亡，抑制肿瘤生长，可高效载铁、载药，并且无生物安全性问题。可作为新型的肿瘤靶向载药递送工具，也为癌症治疗提供了一个新思路，具有较大的应用前景。
[0015]优选地，所述生物细胞膜来源于HEK
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293T细胞系。
[0016]优选地，所述细胞膜仿生纳米囊泡的粒径为100～200nm。
[0017]进一步优选地，所述细胞膜仿生纳米囊泡的粒径为120～160nm。
[0018]再优选地，所述细胞膜仿生纳米囊泡的粒径为150～160nm。
[0019]优选地，所述细胞膜仿生纳米囊泡的电势为
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37mv～
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39mV。
[0020]进一步优选地，所述所述细胞膜仿生纳米囊泡的电势为
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38mV。
[0021]本专利技术上述表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡的制备方法，包括如下步骤：
[0022]S1.在分泌型转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡，其特征在于，由生物细胞膜构成，细胞膜表面表达转铁蛋白。2.根据权利要求1所述细胞膜仿生纳米囊泡，其特征在于，所述细胞膜仿生纳米囊泡的粒径为100～200nm。3.根据权利要求1所述细胞膜仿生纳米囊泡，其特征在于，所述细胞膜仿生纳米囊泡的电势为
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37mv～
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39mV。4.权利要求1～3任一所述表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.在分泌型转铁蛋白基因序列N端插入一段跨膜蛋白基因序列，并带上绿色荧光标签，通过慢病毒感染方式构建出膜上稳定过表达转铁蛋白的细胞系；S2.提取步骤S1膜上稳定过表达转铁蛋白的细胞系的细胞膜，通过挤压出泡的方式制备得到表达转铁蛋白的细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈红波，肖有梅，林靖雄，蔡湘仪，江子斌，程芳，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：