一种扩增激活NK细胞的培养基组合及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种扩增激活NK细胞的培养基组合及其制备方法和应用，所述培养基组合包括诱导培养基、扩增培养基和激活培养基；所述诱导培养基包括基础培养基和诱导组分、所述扩增培养基包括基础培养基和扩增组分、所述激活培养基包括基础培养基和激活组分；所述基础培养基含有血清。本发明专利技术所述培养基组合，既可以活化外周血单个核细胞中的多种免疫细胞，同时对纯化的NK细胞，也可以模拟抗原提呈细胞识别抗原后被活化的状态。三种培养基相辅相成，使得培养得到的NK细胞在扩增倍数、细胞纯度和对肿瘤细胞的杀伤活性等方面都优于现有技术，且与使用滋养层细胞体外扩增NK细胞相比，该培养基组合不使用外来肿瘤细胞，安全性比较好。安全性比较好。

【技术实现步骤摘要】
一种扩增激活NK细胞的培养基组合及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物培养领域，具体涉及一种扩增激活NK细胞的培养基组合及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]NK细胞(自然杀伤细胞，Natural Killer Cell)又称为大颗粒性淋巴细胞，和γδT细胞、NKT细胞在形式和功能上行使着连接获得性免疫和固有免疫桥梁的作用。一方面，当机体发生感染及创伤时，NK细胞通过非肽
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MHC的识别方式快速，广泛地识别抗原，清除病原微生物及变异细胞，发挥固有免疫的作用。另一方面NK细胞能影响T细胞，B细胞，树状细胞等适应性免疫应答细胞的功能。
[0003]在肿瘤的发生发展过程中，NK细胞既可以通过活化性受体直接识别肿瘤细胞并被活化，也可以被辅助细胞活化。这些辅助细胞通过其模式识别受体来应答内外环境的变化，再通过分泌多种可溶性因子或直接接触的方式将信号传导给NK细胞。在人类，已经证实存在的可溶性因子有IL12，IL
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18，typeI IFN,TNF
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α等；直接接触的分子有GITRL/GITR,CD48/2B4，MICA or MICB or ULBP1
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ULBP3/NKG2D,AICL/NKp80等。基于以上原理在体外扩增活化的NK细胞对肿瘤细胞显示出良好的杀伤活性，并应用于肿瘤生物治疗中。
[0004]目前制约NK细胞的临床应用的主要障碍之一就是难以得到足够数量的NK细胞。如何在体外实现NK细胞大规模扩增是目前NK细胞治疗的关键问题。外周血中NK细胞仅占很小的部分，肿瘤病人的外周血中NK细胞的数量和活性往往有明显的下降。不同人NK细胞的性质有很大差异。应用嵌合抗原受体(CAR)修饰NK细胞来治疗肿瘤也对NK细胞数量有很高要求。因此，寻找高效的个性化的NK细胞大规模扩增方法对NK细胞的临床应用有重大意义。
[0005]使用细胞因子扩增NK细胞和使用滋养细胞相比的最大的优点是不使用外来肿瘤细胞，安全性比较好，此外操作更简便。缺点是使用细胞因子扩增NK细胞的效果普遍比滋养细胞方法差，稳定性不够好。因此，开发一种体外扩增和激活NK细胞的方法尤为重要。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种扩增激活NK细胞的培养基组合及其制备方法和应用。
[0007]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种扩增激活NK细胞的培养基组合，所述培养基组合包括诱导培养基、扩增培养基和激活培养基；所述诱导培养基包括基础培养基和诱导组分、所述扩增培养基包括基础培养基和扩增组分、所述激活培养基包括基础培养基和激活组分；所述基础培养基中含有血清。
[0009]本专利技术培养基组合，既可以活化外周血单个核细胞中的多种免疫细胞，创造一个NK细胞生长的合适环境，同时对纯化的NK细胞，也可以模拟抗原提呈细胞识别抗原后被活化的状态。其中，诱导培养基的作用是诱导细胞分化，激活培养基的作用是促进NK细胞的激
活，扩增培养基的作用是促进NK细胞的分裂增殖。三种培养基相辅相成，共同配合，使得培养得到的NK细胞在扩增倍数、细胞纯度和对肿瘤细胞的杀伤活性等方面都优于现有技术，且与使用滋养层细胞体外扩增NK细胞的技术方案相比，该培养基组合不使用外来肿瘤细胞，安全性比较好。
[0010]优选地，所述血清为人血清和/或胎牛血清。
[0011]优选地，所述血清在所述基础培养基中的浓度为0.5
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3％，例如0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0012]优选地，所述诱导组分包括白介素和维生素；所述白介素为白介素2、白介素7、白介素12、白介素15和白介素21的组合。
[0013]本专利技术创造性地发现，诱导组分中的白介素选择特定的白介素2、白介素7、白介素12、白介素15和白介素21的组合，该组合方式与其他白介素的组合方式相比，可以显著提高NK细胞的扩增倍数和杀伤活性。
[0014]优选地，所述白介素7、白介素12、白介素15与白介素21在所述诱导培养基中的浓度比为(1
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3):(1
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3):(1
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3):(1
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3)，其中(1
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3)中的具体点值均可选择1、1.5、2、2.5、3等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0015]进一步地，当上述五种白介素组分以特定的质量配比关系进行组合时，在提高NK细胞的扩增倍数和杀伤活性效果上更加显著。
[0016]优选地，所述白介素7、白介素12、白介素15与白介素21在所述诱导培养基中的浓度独立地为10
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1000ng/mL，例如10ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL、400ng/mL、500ng/mL、600ng/mL、700ng/mL、800ng/mL、900ng/mL、1000ng/mL等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0017]优选地，所述白介素2在所述诱导培养基中的浓度为50
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500单位/mL，例如50单位/mL、100单位/mL、150单位/mL、200单位/mL、250单位/mL、300单位/mL、350单位/mL、400单位/mL、450单位/mL、500单位/mL等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0018]优选地，所述维生素包括维生素C和维生素B12。
[0019]优选地，所述维生素C与维生素B12的摩尔比为(1
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5):(1
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5)，其中(1
‑
5)中的具体点值均可选择1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0020]优选地，所述维生素在所述诱导培养基中的浓度为5
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50μmol/L，例如5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L、30μmol/L、35μmol/L、40μmol/L、45μmol/L、50μmol/L等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0021]优选地，所述扩增组分包括白介素和维生素，所述白介素为白介素2。
[0022]本专利技术还创造性地发现，扩增组分中的白介素组分为单一组分白介素2时，在细胞分裂增殖方面就能获得优异的效果，与其他多种白介素的组合方式相比，其在细胞分裂增殖效果上的水平相当。
[0023]优选地，所述维生素包括维生素C和维生素B12。
[0024]优选地，所述扩增培养基中白介素2的浓度为50
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500单位/mL、维生素C的浓度为5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种扩增激活NK细胞的培养基组合，其特征在于，所述培养基组合包括诱导培养基、扩增培养基和激活培养基；所述诱导培养基包括基础培养基和诱导组分，所述扩增培养基包括基础培养基和扩增组分，所述激活培养基包括基础培养基和激活组分；所述基础培养基中含有血清。2.根据权利要求1所述的扩增激活NK细胞的培养基组合，其特征在于，所述血清为人血清和/或胎牛血清；优选地，所述血清在所述基础培养基中的浓度为0.5
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3％。3.根据权利要求1或2所述的扩增激活NK细胞的培养基组合，其特征在于，所述诱导组分包括白介素和维生素；所述白介素为白介素2、白介素7、白介素12、白介素15和白介素21的组合；优选地，所述白介素7、白介素12、白介素15与白介素21在所述诱导培养基中的浓度比为(1
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3):(1
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3):(1
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3):(1
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3)；优选地，所述白介素7、白介素12、白介素15与白介素21在所述诱导培养基中的浓度独立地为10
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1000ng/mL；优选地，所述白介素2在所述诱导培养基中的浓度为50
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500单位/mL；优选地，所述维生素包括维生素C和维生素B12；优选地，所述维生素C与维生素B12的摩尔比为(1
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5):(1
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5)；优选地，所述维生素在所述诱导培养基中的浓度为5
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50μmol/L。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的扩增激活NK细胞的培养基组合，其特征在于，所述扩增组分包括白介素和维生素，所述白介素为白介素2；优选地，所述维生素包括维生素C和维生素B12；...

【专利技术属性】
技术研发人员：王冶陶，彭昉，俞英豪，
申请(专利权)人：杭州中赢生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：