一种牙鲆肠道上皮细胞系及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种牙鲆肠道上皮细胞系及其构建方法和应用，涉及海洋生物细胞培养领域。该构建方法包括以下步骤：(1)取牙鲆的肠道，去除所述肠道上的脂肪和腹膜后，得到肠壁组织，之后置于装有完全培养液的培养容器中进行贴壁培养；(2)步骤(1)贴壁培养获得的细胞，消化后进行传代培养，传代培养50代，得到所述牙鲆肠道上皮细胞系。利用本发明专利技术的构建方法可以成功构建得到牙鲆肠道上皮细胞系，该细胞系的主要特点是：细胞系可以连续传代50代或以上，生长速度快，传代频率高，能提供大量的牙鲆肠道上皮细胞；细胞的生长状态良好，能稳定增殖，细胞系的主要细胞类型为铺路石样细胞。细胞系的主要细胞类型为铺路石样细胞。细胞系的主要细胞类型为铺路石样细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种牙鲆肠道上皮细胞系及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及海洋生物细胞培养领域，特别是涉及一种牙鲆肠道上皮细胞系及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]细胞培养就是把细胞从生物体中分离出来，在体外模拟体内的生理环境，使之在人工环境下存活并生长，以便于更直接地研究细胞的结构、功能、代谢和细胞对环境诸因素影响的反应等。目前，细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术，它为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。
[0003]肠道细胞不仅承担着鱼体对营养物质消化吸收的功能，同时具有强大的免疫调节功能，是鱼类抵御肠道内有害物质和微生物的重要防线。而肠道上皮细胞(intestinal epithelial cells，IECs)是鱼类肠道细胞的主要功能细胞，是抵御外界环境最重要的屏障。近年来，高密度养殖条件下鱼类肠道炎症已经成为养殖鱼类高死亡率的主要原因，严重阻碍了水产养殖业的可持续发展。鱼类肠道粘膜易与腔内大量的细菌、病毒、生物化学毒素及植物性蛋白饲料接触而发生肠道炎症损伤，引起鱼类肠道粘膜增厚并充血，肠上皮细胞滤泡消失，微绒毛变短，杯状细胞增多等症状。因此，建立体外鱼类肠上皮细胞模型对鱼类肠道炎症损伤机制的研究具有重大意义。
[0004]牙鲆(Paralichthys olivaceus)是一种冷温性底栖鱼类，具有潜沙习性，广泛分布于中国、日本、韩国沿海。21世纪以来，牙鲆养殖规模虽然不断扩大，但由于饲养管理不当，如投饵质量低下、水质差、水温不稳定等影响，各种细菌、病毒以及寄生虫等病原引起的疾病日益加剧。其中，由弧菌属(Vibrio)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)等一系列革兰氏阴性菌引发的腹水病是牙鲆养殖过程重大疾病之一，给全球水产养殖业造成极大害。然而，由于缺乏牙鲆肠道上皮细胞模型，限制了牙鲆肠道上皮细胞的生理功能和病菌致病机制的进一步研究。尽管已经在一些鱼类上建立了肠道上皮细胞的原代培养方法，但是由于鱼种的不同，其所用的细胞培养条件和方法亦有所不同。相较其他鱼类，牙鲆肠道上皮细胞分裂能力有限且周期长，增殖缓慢，难以在短时间内获得大量细胞。本专利技术结合大量的科学实验，对牙鲆肠道上皮细胞系的建立进行了研究，旨在建立一种牙鲆肠道上皮细胞模型，弥补现有技术的不足，推动牙鲆肠道生理功能和病菌致病机制的研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种牙鲆肠道上皮细胞系及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，利用本专利技术的构建方法可以成功构建得到牙鲆肠道上皮细胞系，该细胞系可以连续传代50代或以上，能稳定增殖。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0007]本专利技术提供一种牙鲆肠道上皮细胞系的构建方法，包括以下步骤：
[0008](1)取牙鲆的肠道，去除所述肠道上的脂肪和腹膜后，得到肠壁组织，之后置于装
有完全培养液的培养容器中进行贴壁培养；
[0009](2)步骤(1)贴壁培养获得的细胞，消化后进行传代培养，传代培养50代，得到所述牙鲆肠道上皮细胞系；
[0010]在步骤(1)中，所述完全培养液包括胎牛血清、β
‑
巯基乙醇、人碱性成纤维细胞生长因子、人表皮细胞生长因子、非必需氨基酸、庆大霉素、青霉素、链霉素和胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒。
[0011]进一步地，所述完全培养液还包括基础培养液，所述基础培养液为DMEM培养液。
[0012]进一步地，所述胎牛血清和所述β
‑
巯基乙醇在所述完全培养液中的体积分数分别为20％和0.1％，所述人碱性成纤维细胞生长因子、所述人表皮细胞生长因子、所述非必需氨基酸、所述庆大霉素、所述青霉素、所述链霉素和所述胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒在所述完全培养液中的质量分数分别为0.01％、0.004％、1％、0.1％、1％、1％和1％。
[0013]进一步地，在步骤(2)中，所述传代培养传至第10代时，所述完全培养液中胎牛血清的体积分数调整为15％。
[0014]进一步地，在步骤(2)中，所述传代培养传至第20代时，所述完全培养液去除人碱性成纤维细胞生长因子和庆大霉素。
[0015]进一步地，在步骤(1)中，所述贴壁培养在24℃，5％CO2的培养条件下进行。
[0016]进一步地，在步骤(1)中，所述牙鲆的体重为15
±
0.5g。
[0017]进一步地，在步骤(2)中，所述传代培养按照细胞密度1:(1
‑
2)的比例进行。
[0018]本专利技术还提供一种根据上述的构建方法构建得到的牙鲆肠道上皮细胞系。
[0019]本专利技术还提供上述的牙鲆肠道上皮细胞系在外源基因表达中的应用。
[0020]本专利技术公开了以下技术效果：
[0021]本专利技术针对牙鲆肠道上皮细胞增殖缓慢的问题进行培养条件的摸索工作，专利技术出一种能在4～5天传代一次的完全培养液。
[0022]本专利技术提供的牙鲆肠道上皮细胞系的构建方法，重复性强，取材的牙鲆体重恰当(15
±
2g)，这种规格的鱼具有分化程度低，分裂潜能大的优势)，摸索的细胞培养液营养成分全面，能够完全适应细胞生长增殖。利用本专利技术的构建方法可以成功构建得到牙鲆肠道上皮细胞系，该细胞系主要特点是：细胞系可以连续传代50代或以上，生长速度快，传代频率高，能提供大量的牙鲆肠道上皮细胞；细胞的生长状态良好，能稳定增殖，细胞系的主要细胞类型为铺路石样细胞。
附图说明
[0023]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0024]图1为倒置显微镜下观察传代培养的牙鲆肠道上皮细胞；其中，A：牙鲆肠道上皮细胞原代培养物；B：牙鲆肠道上皮细胞2代；C：牙鲆肠道上皮细胞27代；D：牙鲆肠道上皮细胞36代；A
‑
D中，标尺均为200μm；
[0025]图2为牙鲆肠道上皮细胞25代在24℃，5％CO2培养下的生长曲线；
[0026]图3为JEM
‑
1200EX透射电镜下观察牙鲆肠道上皮细胞25代；其中，A：牙鲆肠道上皮细胞整体结构；B：牙鲆肠道上皮细胞微绒毛结构；A中标尺＝10μm；B中标尺＝2μm；
[0027]图4为牙鲆肠道上皮细胞25代转染X fect转染试剂；其中，A：明场下牙鲆肠道上皮细胞；B：转染后荧光下观察牙鲆肠道上皮细胞；A和B中，标尺均为200μm。
具体实施方式
[0028]现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0029]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牙鲆肠道上皮细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取牙鲆的肠道，去除所述肠道上的脂肪和腹膜后，得到肠壁组织，之后置于装有完全培养液的培养容器中进行贴壁培养；(2)步骤(1)贴壁培养获得的细胞，消化后进行传代培养，传代培养50代，得到所述牙鲆肠道上皮细胞系；在步骤(1)中，所述完全培养液包括胎牛血清、β
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巯基乙醇、人碱性成纤维细胞生长因子、人表皮细胞生长因子、非必需氨基酸、庆大霉素、青霉素、链霉素和胰岛素
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转铁蛋白
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硒。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述完全培养液还包括基础培养液，所述基础培养液为DMEM培养液。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述胎牛血清和所述β
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巯基乙醇在所述完全培养液中的体积分数分别为20％和0.1％，所述人碱性成纤维细胞生长因子、所述人表皮细胞生长因子、所述非必需氨基酸、所述庆大霉素、所述青霉素、所述链霉素和所述胰岛素
‑
转铁蛋白
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【专利技术属性】
技术研发人员：修云吉，郭宝山，苏琳，逄云飞，周顺，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：