非磷酸化及非泛素化的CREPT蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种非磷酸化及非泛素化的CREPT蛋白及其应用。具体而言，本发明专利技术涉及一种蛋白，其通过修饰CREPT或其同源蛋白而得到，所述修饰使得当所述蛋白位于G1末期或G1/S转换期的真核细胞中时，经修饰的蛋白保持非磷酸化及非泛素化状态以使其不被降解，导致双MCM六聚体不能分离，从而使细胞周期停止，产生基因组应激反应，最终导致细胞死亡。本发明专利技术还涉及筛选CREPT的非磷酸化及非泛素化修饰剂的方法和鉴别物质是否为CREPT的磷酸化抑制剂的方法，以及利用CREPT来鉴别G1末期或G1/S转换期的真核细胞的方法，以及基于非磷酸化及非泛素化的CREPT使癌细胞凋亡来治疗癌症的方法。化的CREPT使癌细胞凋亡来治疗癌症的方法。化的CREPT使癌细胞凋亡来治疗癌症的方法。

【技术实现步骤摘要】
非磷酸化及非泛素化的CREPT蛋白及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，更具体而言，涉及一种能够保持非磷酸化及非泛素化状态的CREPT蛋白及其应用。

技术介绍

[0002]DNA在细胞周期的S期进行复制，错误的DNA复制会在生物体内的干细胞中积累，并与细胞死亡和个体衰老密切相关。因此，决定细胞命运的DNA复制需要受到严格的控制。真核细胞的DNA复制机制十分复杂，DNA复制的起始点位于细胞周期的G1期，pre
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RC(pre
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replication complex)蛋白加载在基因组所有潜在起始点上。首先，具有ATPase活性的ORC复合体(origin recognition complex，ORC1
‑
6)被募集到复制起点。进一步的，CDC6、CDT1(CDC10
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dependent transcript 1)和MCM2
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7(mini
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chromosome maintenance)的六聚体复合体加载到OCR复合体上形成MCM解旋酶复合体。这一步被称为复制起始许可(origin licensing)。复制起始的激活涉及pre
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IC(pre
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initiation complex)复合体的形成和MCM解旋酶复合体的激活。Pre
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IC的组装由DDK(DBF4
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dependent kinase)和CDK(Cyclinr/>‑
dependent kinase)在G1/S转换时期触发。DDK和CDK使几种参与DNA复制的蛋白例如MCM10、CDC45、RECQL4(ATP
‑
dependent DNA helicase Q4)、treslin、GINS和TOPBP1(DNAtopoisomerase2
‑
binding protein 1)磷酸化。此外，DDK和CDK也可以磷酸化MCM2
‑
7复合体中的几个碱基，导致解旋酶激活并解旋DNA。在解旋酶激活期间，加载在DNA上的MCM2
‑
7双六聚体分成两个单独的六聚体，在从复制起始点开始的两个复制叉上持续解旋。
[0003]细胞周期受到泛素
‑
蛋白酶体系统(UPS)介导的Cyclin相关蛋白和CDK抑制剂降解的精确调控。UPS通过将泛素添加到底物蛋白的赖氨酸(K)残基供蛋白酶体识别来实现高效的蛋白降解。有三种主要类型的酶控UPS：泛素激活酶(E1)、泛素结合酶酶(E2)和泛素连接酶(E3)。连接酶E3是最多样化的酶，其可提供针对靶标的特异性。在G1/S期，由SKP1、CUL1和F
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box蛋白(FBP)组成的RING
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finger亚家族E3连接酶的SCF复合物识别待降解的底物。FBP主要决定SCF复合物的靶标特异性。SCF复合物更倾向于与磷酸化降解决定子(phosphodegron)结合，磷酸化降解决定子是产生供E3连接酶识别的表面的磷酸化底物基序。FBP家族成员SKP2(S期激酶相关蛋白2)是调节G1/S转换的E3连接酶之一。SKP2
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CKS1
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p27复合物介导CDK抑制剂p27的蛋白酶体降解并释放Cyclin E/CDK2以促进G1/S转换。
[0004]细胞周期的调控与肿瘤的发生发展有着紧密的关系，本实验室在前期研究中在人细胞中发现并克隆了一个与细胞周期调控和肿瘤形成相关的基因CREPT(Cell
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cycle Related and Expression
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elevated Protein in Tumor，中国专利号200510135513.4，其相应的蛋白序列见SEQ ID NO:4)。进而发现该基因在多种真核生物中存在十分保守的同源基因，例如在酵母、小鼠、犬、猫、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫和拟南芥的细胞中。已知CREPT蛋白通过调控Cyclin D1和B1的表达来促进细胞增殖。
[0005]然而，CREPT具体如何调控细胞周期的机理尚不清楚。

技术实现思路

[0006]本专利技术人经大量研究发现，人细胞中的CREPT蛋白通过在G1/S转换期发生降解来推动细胞进入S1期，由此发挥细胞周期调控作用。
[0007]具体而言，本专利技术人发现，在同一培养物中的多个细胞中，CREPT在部分细胞中表达量很低，而在其他细胞中保持较高表达，进而发现这种低表达现象是由于在G1/S转换期CREPT的降解所致，而CREPT的降解对于细胞由G1期进入S期至关重要。CREPT的降解由泛素化修饰来介导，而该泛素化修饰依赖于CREPT的两个位点S134和S166的磷酸化。专利技术人进一步发现，如果使CREPT蛋白的134和166位点在G1/S转换期保持非磷酸化状态且使该蛋白保持非泛素化状态，则CREPT蛋白不能被降解，这种不能被降解的CREPT蛋白不能与MCM复合体分离，由此会导致细胞死亡。
[0008]此外，专利技术人还发现，非人真核细胞中的同源蛋白具有与人CREPT相同或相似的细胞周期调控作用和调控机理，而且人CREPT蛋白在表达于非人真核细胞中时，这种细胞周期调控作用依然存在。
[0009]基于上述发现，专利技术人完成了本专利技术。
[0010]在第一方面，本专利技术提供一种通过对SEQ ID No:4的134和166位点进行磷酸化失活修饰而得到的蛋白，所述磷酸化失活修饰使得当所述蛋白位于G1末期或G1/S转换期的真核细胞中时，所述134和166位点保持非磷酸化状态且所述蛋白保持非泛素化状态，从而使所述蛋白在所述真核细胞中不被降解。
[0011]在第一方面中，所述真核细胞可以是人、酵母、小鼠、犬、猫、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫或拟南芥的细胞，优选人细胞，更优选人癌细胞。
[0012]在第一方面中，所述134和166位点上的所述磷酸化失活修饰可以是氨基酸突变和/或化学修饰。
[0013]在第一方面中，所述134和166位点上的所述磷酸化失活修饰可以是将丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)。
[0014]在第一方面中，本专利技术还提供一种蛋白，其与上述每种蛋白具有(i)90％以上的序列同一性和(ii)相同的134和166位点上的磷酸化失活修饰。在第二方面，本专利技术提供一种蛋白，其在第一方面的蛋白的N端和/或C端连接有标签序列或引导序列。
[0015]在第三方面，本专利技术提供编码第一和第二方面所述的蛋白的核酸。
[0016]在第四方面，本专利技术提供包含第三方面所述的核酸的载体。
[0017]在第五方面，本专利技术提供包含第四方面所述的载体的细胞。
[0018]在第六方面，本专利技术提供第一至第五方面所述的蛋白、核酸或载体在制备抑制真核细胞增殖、抑制真核细胞的DNA复制、调控真核细胞的细胞周期或杀灭真核细胞的试剂中的应用。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蛋白，其通过对SEQ ID No:4的134和166位点进行磷酸化失活修饰而得到，所述磷酸化失活修饰使得当所述蛋白位于G1末期或G1/S转换期的真核细胞中时，所述134和166位点保持非磷酸化状态且所述蛋白保持非泛素化状态，从而使所述蛋白在所述真核细胞中不被降解，进而导致细胞周期阻滞和细胞凋亡。2.如权利要求1所述的蛋白，其中，所述真核细胞是人、酵母、小鼠、犬、猫、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫或拟南芥的细胞，优选人细胞，更优选人癌细胞。3.如权利要求1所述的蛋白，其中，所述134和166位点上的所述磷酸化失活修饰是氨基酸突变和/或化学修饰。4.如权利要求1所述的蛋白，其中，所述134和166位点上的所述磷酸化失活修饰是将丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)。5.一种蛋白，其与权利要求1至4中任一项所述的蛋白具有(i)90％以上的序列同一性和(ii)相同的134和166位点上的磷酸化失活修饰。6.在权利要求1至5中任一项所述的蛋白的N端和/或C端连接有标签序列或引导序列的蛋白。7.编码权利要求4所述的蛋白的核酸。8.包含权利要求7所述的核酸的载体。9.包含权利要求8所述的载体的细胞。10.权利要求1
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6中任一项所述的蛋白、权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的载体在制备抑制真核细胞增殖、抑制真核细胞的DNA复制、调控真核细胞的细胞周期或杀灭真核细胞的试剂中的应用。11.权利要求1
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6中任一项所述的蛋白、权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的载体在制备抗癌药中的应用。12.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：i)向受试者施用有效量的权利要求1
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6中任一项所述的蛋白、权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的载体；或者ii)利用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术编辑受试者癌细胞基因组中的CRPET基因，以使所述癌细胞表达权利要求4所述的蛋白。13.如权利要求12所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物，优选是人。14.如权利要求12所述的方法，其中，所述i)还包括：在向受试者施用有效量的所述蛋白、核酸或载体之前、过程中或之后，降低或消除受试者的癌细胞中的野生型CREPT的表达。15.源自非人真核生物的人CREPT的同源蛋白，其在对应于SEQ ID No:4的134和166位点的同源性位点处具有磷酸化失活修饰，所述磷酸化失活修饰使得当所述同源蛋白位于所述真核生物的G1末期或G1/S转换期的细胞中时，所述对应于SEQ ID No:4的134和166位点的同源性位点保持非磷酸化状态且所述同源蛋白保持非泛素化状态，从而使所述同源蛋白在所述细胞中不会被降解，进而导致细胞周期阻滞和细胞凋亡。16.如权利要求15所述的同源蛋白，其中，所述真核生物是酵母、小鼠、犬、猫、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫或拟南芥。17.如权利要求15所述的同源蛋白，其中，所述对应于SEQ ID No:4的134和166位点的同源性位点上的所述磷酸化失活修饰是氨基酸突变和/或化学修饰。
18.如权利要求15所述的同源蛋白，其中，所述对应于SEQ ID No:4的134和166位点的同源性位点上的所述磷酸化失活修饰是将丝氨酸突变为丙氨酸。19.如权利要求15所述的同源蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No:6。20.一种蛋白，其选自：i)在权利要求15至19中任一项所述的蛋白的N端和/或C端连接有标签序列或引导序列的蛋白；或ii)与权利要求15至19中任一项所述的蛋白具有90％以上的序列同一性且在所述同源性位点上具有相同的磷酸化失活修饰的蛋白。21.编码权利要求18或19所述的同源蛋白的核酸。22.包含权利要求21所述的核酸的载体。23.包含权利要求22所述的载体的细胞。24.一种鉴别处于G1末期或G1/S转换期的真核细胞的方法，所述方法包括：1)制备能够内源性表达带可检测标记的人CREPT蛋白或其在非人真核生物中的同源蛋白的真核细胞，并在允许细胞周期进行的条件下培养该真核细胞；2)利用所述可检测标记观察或测量所述真核细胞中的所述人CREPT蛋白或所述同源蛋白的表达水平；3)将所述人CREPT蛋白或所述同源蛋白的表达水平最低的细胞鉴别为处于G1末期或G1/S转换期的细胞；其中，所述人CREPT蛋白的序列为SEQ ID No:4。25.如权利要求24所述的方法，其中，所述可检测标记是同位素标记、荧光标记或量子点标记或者是能够进一步与同位素标记、荧光标记或量子点标记结合的标记，优选为GFP。26.如权利要求24所述的方法，其中，所述真核细胞是人、酵母、小鼠、犬、猫、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫或拟南芥的细胞。27.一种筛选CREPT蛋白的非磷酸化非泛素化修饰剂的方法，其中，所述修饰剂使CREPT蛋白的S134和S166位点保持持续非磷酸化状态，从而使所述CREPT蛋白在真核细胞中保持非泛素化状态且不会降解；所述CREPT蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:4，所述方法包括：i)将模拟非磷酸化状态的候选修饰剂加入表达CREPT蛋白的被同步至G1期的真核细胞中，然后释放并培养所述真核细胞，并在所述真核细胞存活时检查所述CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化水平；或者ii)在体外将模拟非磷酸化状态的候选修饰剂与CREP...

【专利技术属性】
技术研发人员：常智杰，任芳丽，王银银，宋云皓，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：