休闲豆干特定腐败菌的分离鉴定及靶向控制方法技术

本发明专利技术涉及豆干防腐技术领域，公开了休闲豆干特定腐败菌的分离鉴定及靶向控制方法，包括以下步骤：S1、利用宏基因组学技术分离鉴定休闲豆干中特定腐败菌；S2、筛选具备良好抑菌性能的抑菌剂；S3、优化复合抑菌剂配方。本发明专利技术先利用宏基因组学技术分离鉴定出休闲豆干中的特定腐败菌，再筛选具备良好抑菌性能的抑菌剂，再通过单因素实验和正交试验优化和复配天然抑菌剂，可以精确地筛选出对休闲豆干中细菌抑制效果最佳的抑菌剂的浓度和种类，以及其最佳组合，进而可以对休闲豆干特定腐败菌进行靶向控制，有效控制豆干中微生物污染，降低豆干贮藏时的菌落数量，延长休闲豆干的货架期。延长休闲豆干的货架期。延长休闲豆干的货架期。

【技术实现步骤摘要】
休闲豆干特定腐败菌的分离鉴定及靶向控制方法


[0001]本专利技术涉及豆干防腐
，具体是休闲豆干特定腐败菌的分离鉴定及靶向控制方法。

技术介绍

[0002]豆干是豆腐的再加工制品，具有营养丰富、均衡，容易被人体消化吸收的特点，其中，休闲豆干是将豆干经过卤制、调味、杀菌等工艺加工而成的小包装即食食品，因具有独特的风味和丰富的营养物质而颇受消费者喜爱；休闲豆干水分含量较大，富含蛋白质和脂肪，在加工、储运、销售过程中，极易因微生物滋生而腐败变质，导致客户及出口二次检测不达标，从而导致损失；因此，控制微生物是提高休闲豆干品质和货架期的核心因素；而通过抑菌剂和物理防腐保鲜均能较好抑制致病微生物的繁殖，提高休闲豆干品质和货架期，目前豆制品国家标准要求菌落总数限量为104CFU
·
g
‑1(即4lg CFU
·
g
‑1)，市场上休闲豆干保质期普遍为45天，少数产品甚至更短。
[0003]其中，化学抑菌剂对人体的毒副作用、致癌已让人们意识到它的危险性；物理防腐保鲜方法要求技术性强、设备维修难、成本比较高；而生物抑菌剂直接来源于生物体自身组成成分或其代谢产物，具有无味、无毒、安全等特点，此外生物抑菌剂一般都可被生物降解，不会造成二次污染，越来越受到关注与重视；根据来源的不同，生物抑菌剂主要被分为植物、动物、和微生物源三类；植物源抑菌剂通常分为酚类物质、植物多糖、植物精油三大类，动物源抑菌剂主要有壳聚糖、蜂胶和鱼精蛋白，微生物源抑菌剂主要有乳酸链球菌素、溶菌酶、植物乳杆菌素。
[0004]由于单一抑菌剂生物保鲜效果有限，产品往往达不到预期品质，进而发展出复合生物抑菌剂；它是将多种不同功能的生物抑菌剂按一定的比例混合，形成一种保鲜性能优越的复合生物保鲜产品；为了优化和复配天然抑菌剂，需要分离、鉴定休闲豆干中特定腐败菌，并对特定腐败菌进行靶向控制，提高抑菌剂的抑菌效果，但是现在采用的方法均不能科学地选择合适的抑菌剂种类和浓度，进而导致休闲豆干保鲜效果不佳。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供休闲豆干特定腐败菌的分离鉴定及靶向控制方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]休闲豆干特定腐败菌的分离鉴定及靶向控制方法，包括以下步骤：
[0008]S1、利用宏基因组学技术分离鉴定休闲豆干中特定腐败菌：针对疑似腐败变质的休闲豆干样品，通过平板培养法从豆干样品中分离出优势的腐败菌，定义为特定腐败菌，再采用16S rDNA基因序列鉴定特定腐败菌；
[0009]S2、筛选具备良好抑菌性能的抑菌剂：以分离到的特定腐败菌为指示菌，测定壳聚糖、乳酸链球菌素、溶菌酶、Vc、茶多酚、纳他霉素和ε
‑
聚赖氨酸7种常见抑菌剂对指示菌的
最低抑菌浓度，筛选出具备良好抑菌性能的抑菌剂；
[0010]S3、优化复合抑菌剂配方：以筛选到的抑菌剂为研究对象，有针对性进行单因素试验，并采用响应面法确定复合抑菌剂的最佳配方。
[0011]作为本专利技术再进一步的方案：所述S1步骤中特定腐败菌分离鉴定的具体方法如下：
[0012]S11、随机挑选三个疑似变质的休闲豆干，取样后，加入到100ml灭菌水中，振动、稀释后得到菌悬液；
[0013]S12、将接种环高温灭菌后，以无菌操作挑取菌悬液一环，在平板培养基上平行划线3～4道；经培养后在沿划线处长出菌落；
[0014]S13、挑取单一菌落，经过离心分离后，得到DNA沉淀物，取DNA沉淀物，进行基因组的提取；
[0015]S14、以提取的基因组为模板，由引物介导酶促合成特异性DNA片段，进行基因扩增；再测定其基因序列；将测定的基因序列与基因数据库中的基因序列对比，确定腐败菌种属。
[0016]作为本专利技术再进一步的方案：所述S2步骤中抑菌剂筛选的具体方法如下：
[0017]S21、样品的制备：精确称取适量壳聚糖、乳酸链球菌素、溶菌酶、Vc、茶多酚、纳他霉素和ε
‑
聚赖氨酸样品，于250mL锥形瓶中，加入灭菌水，轻轻混合，置于摇床上震荡溶解，取样液放入离心机中离心分离，在超净台内用无菌注射器吸取适量上清液，0.22μm滤膜过滤，制得母液，用灭菌水稀释至所需始浓度，然后用灭菌水在准备好的试管中两倍梯度稀释，每管1mL稀释后的样品液体；备用；
[0018]S22、菌液的制备：从新鲜培养的平板上挑取2～3单个菌落，接种于5mLMH培养基中进行培养约，再采用分光光度计测OD
600
；用MH培养基调节菌液浓度至1.0，再稀释1000倍备用；
[0019]S23、样品的检测：将S22步骤中得到的备用菌液与S21步骤中稀释好的样品等体积混合；同时以菌液和灭菌水等体积混合为阳性对照，以培养基和灭菌水等体积混合为阴性对照；混匀后，盖上塞子，放入培养箱进行培养，并观察结果；以便筛选具备良好抑菌性能的抑菌剂；
[0020]作为本专利技术再进一步的方案：所述S3步骤中复合抑菌剂配方优化的具体方法如下：
[0021]S31、单因素实验：从筛选出来的抑菌剂中，先选取一种抑菌剂进行单因素实验分析，即依次选取不同质量浓度的该种抑菌剂，而其余种类的抑菌剂浓度不变，检测休闲豆干样品中菌落总数；接着，再选另一种抑菌剂进行单因素实验分析；同理，依次对所有抑菌剂进行单因素实验分析；即每次只对一种抑菌剂进行单因素实验分析，而其他抑菌剂质量浓度均固定不变；
[0022]S32、正交试验：通过单因素试验筛选出若干种单一抑菌剂的最合适质量浓度，将每种抑菌剂选择最合适质量浓度及相邻2个质量浓度各设计3个水平，通过正交试验因素水平表将其复配，每组重复3次；以菌落总数为参考指标进行试验优化，确定复合保鲜剂的最佳配比，与极差分析结果对比后进行验证试验。
[0023]作为本专利技术再进一步的方案：所述S21步骤中摇床的温度为30℃，转速为200rpm，
震荡溶解时间为30min，离心机的转速为10000rpm，离心分离时间为3min。
[0024]作为本专利技术再进一步的方案：所述S22步骤中MH培养基的温度37℃，转速为200rpm培养，培养时间为4～5h。
[0025]作为本专利技术再进一步的方案：所述S22步骤中得到的备用菌液的等待时间不超过15min，所述S23步骤中培养箱的温度为37℃，培养时间为15h。
[0026]作为本专利技术再进一步的方案：所述S31步骤中在储存10、20、30天时检测休闲豆干样品中菌落总数，按照GB 4789.2
‑
2016《食品微生物学检验菌落总数》测定；分别分析不同质量浓度的抑菌剂对豆干菌落总数的影响。
[0027]作为本专利技术再进一步的方案：所述S32步骤中在储存30天时检测休闲豆干样品中菌落总数，按照GB 4789.2
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2016《食品微生物学检验菌落总数》测定，确定复合保鲜剂的最本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.休闲豆干特定腐败菌的分离鉴定及靶向控制方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、利用宏基因组学技术分离鉴定休闲豆干中特定腐败菌：针对疑似腐败变质的休闲豆干样品，通过平板培养法从豆干样品中分离出优势的腐败菌，定义为特定腐败菌，再采用16S rDNA基因序列鉴定特定腐败菌；S2、筛选具备良好抑菌性能的抑菌剂：以分离到的特定腐败菌为指示菌，测定壳聚糖、乳酸链球菌素、溶菌酶、Vc、茶多酚、纳他霉素和ε
‑
聚赖氨酸7种常见抑菌剂对指示菌的最低抑菌浓度，筛选出具备良好抑菌性能的抑菌剂；S3、优化复合抑菌剂配方：以筛选到的抑菌剂为研究对象，有针对性进行单因素试验，并采用响应面法确定复合抑菌剂的最佳配方。2.根据权利要求1所述的休闲豆干特定腐败菌的分离鉴定及靶向控制方法，其特征在于，所述S1步骤中特定腐败菌分离鉴定的具体方法如下：S11、随机挑选三个疑似变质的休闲豆干，取样后，加入到100ml灭菌水中，振动、稀释后得到菌悬液；S12、将接种环高温灭菌后，以无菌操作挑取菌悬液一环，在平板培养基上平行划线3～4道；经培养后在沿划线处长出菌落；S13、挑取单一菌落，经过离心分离后，得到DNA沉淀物，取DNA沉淀物，进行基因组的提取；S14、以提取的基因组为模板，由引物介导酶促合成特异性DNA片段，进行基因扩增；再测定其基因序列；将测定的基因序列与基因数据库中的基因序列对比，确定腐败菌种属。3.根据权利要求1所述的休闲豆干特定腐败菌的分离鉴定及靶向控制方法，其特征在于，所述S2步骤中抑菌剂筛选的具体方法如下：S21、样品的制备：精确称取适量壳聚糖、乳酸链球菌素、溶菌酶、Vc、茶多酚、纳他霉素和ε
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聚赖氨酸样品，于250mL锥形瓶中，加入灭菌水，轻轻混合，置于摇床上震荡溶解，取样液放入离心机中离心分离，在超净台内用无菌注射器吸取适量上清液，0.22μm滤膜过滤，制得母液，用灭菌水稀释至所需始浓度，然后用灭菌水在准备好的试管中两倍梯度稀释，每管1mL稀释后的样品液体；备用；S22、菌液的制备：从新鲜培养的平板上挑取2～3单个菌落，接种于5mLMH培养基中进行培养约，再采用分光光度计测OD
600
；用MH培养基调节菌液浓度至1.0，再稀释1000倍备用；S23、样品的检测：将S22步骤中得到的备用菌液与S21步骤中稀释好的样品等体积混合；同时以菌液和...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄展锐，赵良忠，王建荣，李明，周小虎，陈浩，周晓洁，周劲松，刘特元，刘忠祥，王秋普，
申请(专利权)人：平江县劲仔食品有限公司，
类型：发明
国别省市：