一种包埋微生物的微胶囊及其制备方法及包埋率检测方法技术

本发明专利技术涉及一种包埋微生物的微胶囊及其制备方法及包埋率检测方法，该制备方法包括：步骤一、制备种子液；步骤二、制备难溶性钙盐悬浊液；步骤三、制备新鲜培养基；步骤四、调整pH；步骤五、制备含菌培养基；步骤六、包埋。本发明专利技术的有益效果是：能缩短固定化微生物菌剂的生产步骤，节约了生产时间，极大地提高了生产效率；并且包埋生成的微胶囊粒径小，应用范围更广。应用范围更广。应用范围更广。

【技术实现步骤摘要】
一种包埋微生物的微胶囊及其制备方法及包埋率检测方法


[0001]本专利技术涉及微生物菌剂
，具体涉及一种包埋微生物的微胶囊及其制备方法及包埋率检测方法。

技术介绍

[0002]随着植物保护工作有力开展，农业生物防治技术作为一种新型的植物病虫害防治技术，因具有环境友好，无耐药性等优点，正逐步进入大众视野。生防菌剂则是利用有益微生物防治植物病害的各种措施；利用有益微生物杀灭或压低病原生物数量以控制植物病害发生、发展。
[0003]目前，农业上应用微生物，主要是以芽孢杆菌为主。且目前市面上投入到大规模的工业化生产，对环境无害，广谱性强菌种主要有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌等，占农业用菌种的绝大部分，在农业应用中取得了非常好的效果，这些有益菌对由真菌、细菌引起的多种病害都有很好的预防和治疗作用。真菌、细菌病害是病害中占比最大的病害，这些病害严重威胁着作物的生产。
[0004]但就目前而言，生防菌剂的产品中的菌体大多数仍以游离的形态存在，直接施用于植物上存在有效期短，细菌定殖困难等缺点，影响其生物防治的效果。通过固定化微生物技术，可以将菌体固定于多孔的载体材料中，为菌体提供保护层的同时，其释放的代谢产物也能由载体材料上的孔隙释放出来，作用于植物。这种方式解决了游离菌体易流失，对外界环境抵抗能力弱，定殖困难的缺点。目前，固定化微生物主要通过物理或化学方法，将菌株固定于载体上，主要包括吸附法、包埋法、交联法。其中，包埋法较为常见，常用的包埋材料主要有聚乙烯醇(PVA)，聚丙烯醇、琼脂、硅胶、壳聚糖、海藻酸钠等，海藻酸钠作为一种高分子生物材料，具有廉价、易获得、化学性质稳定、无生物毒性等优点，常被用来与Ca2+交联形成海藻酸钙微胶囊，将菌体包埋于其中，形成的微胶囊机械强度和生物传质性能较好，一段时间后能自然降解，对环境十分友好。
[0005]目前，海藻酸钙微胶囊的制备工艺均为先发酵，再包埋，即先将海藻酸钠凝胶与菌液混合均匀，再滴加至含氯化钙的溶液中，交联一段时间后形成固定化小球，随后打捞出来，得到固定化微生物颗粒。但这种技术存在制备步骤繁琐、颗粒大小不均一、装置复杂等缺点，且制得的固定化小球直径通常大于2mm，《CN201220476341.2一种微生物液体发酵包埋固定化装置》、《CN110452900A一种包埋降解微生物的PVA
‑
SA复合固定化载体的制备方法》，实际应用范围有限。
[0006]因此，现提出一种包埋微生物的微胶囊及其制备方法及包埋率检测方法，该制备方法能缩短固定化微生物菌剂的生产步骤，节约了生产时间，极大地提高了生产效率；并且包埋生成的微胶囊粒径小，应用范围更广；此外，本专利技术还提供了对应固定化技术的菌株包埋率测定方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，解决了当前固定化微生物技术步骤繁琐，微胶囊颗粒粒径较大的问题，本专利技术提供了一种包埋微生物的微胶囊及其制备方法及包埋率检测方法，能同时实现发酵和包埋，得到一种粒径极小的微胶囊，仅2～10μm，使得产品的应用范围更广，且在发酵的同时完成固定化，提高了生产效率，节约了成本，且无论目标菌株是否具有产酸能力，都能实现包埋。
[0008]本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：
[0009]一方面，本专利技术提供了一种包埋微生物的微胶囊及其制备方法，包括以下步骤：
[0010]步骤一、制备种子液
[0011]将目标菌株在无菌条件下转接于已灭菌的种子培养基中，置于恒温培养箱中培养，得种子液；
[0012]其中，所述目标菌株为产酸菌株；
[0013]步骤二、制备难溶性钙盐悬浊液
[0014]称取一定量的难溶性钙盐，用蒸馏水浸泡过夜，然后用蒸馏水洗涤2～3次，烘干或自然晾干，得干燥后的难溶性钙盐；
[0015]然后，称取一定量干燥后的难溶性钙盐，配置成0.05wt％的难溶性钙盐悬浊液，紫外辐射灭菌，待用；
[0016]步骤三、制备新鲜培养基
[0017]配制目标菌株生长专用的培养基，按0.5～5wt％的比例添加海藻酸钠，待海藻酸钠充分溶解后，121℃灭菌20min，得新鲜培养基，冷却后待用；
[0018]步骤四、调整pH
[0019]将步骤一中的种子液用0.5mol/L K2HPO4溶液调节pH至7；
[0020]步骤五、制备含菌培养基
[0021]将步骤五中调节pH后的种子液按5～10％的比例接种至步骤三制得的新鲜培养基中，添加步骤二制得的难溶性钙盐悬浊液，混匀，得含菌培养基；
[0022]其中，所述难溶性钙盐悬浊液的添加量，以钙盐质量计，为新鲜培养基中海藻酸钠质量的1/2～1/5；
[0023]步骤六、包埋
[0024]将步骤五得到的含菌培养基置于培养箱中37℃，200rpm/min培养1～3d，待培养基中难溶性钙盐完全消失，视为发酵完成，完成目标菌的固定化，得含有微胶囊颗粒的液体制剂，该微胶囊颗粒即为所述包埋微生物的微胶囊。
[0025]另一方面，本专利技术还提供了一种包埋微生物的微胶囊及其制备方法，包括以下步骤：
[0026]步骤S1、制备目标菌种子液
[0027]将目标菌株在无菌条件下转接于已灭菌的种子培养基中，置于恒温培养箱中培养，得目标菌种子液；
[0028]其中，所述目标菌株为无产酸能力菌株或产酸能力较弱的耐高温菌株或芽孢杆菌菌株；步骤S2、制备辅助菌种子液
[0029]将辅助菌菌株在无菌条件下转接于已灭菌的培养基中，置于恒温培养箱中培养，
得辅助菌种子液，待用；
[0030]其中，所述辅助菌为产酸菌，且辅助菌菌株与目标菌菌株之间无拮抗作用；
[0031]步骤S3、制备难溶性钙盐悬浊液
[0032]称取一定量的难溶性钙盐，用蒸馏水浸泡过夜，然后用蒸馏水洗涤2～3次，烘干或自然晾干，得干燥后的难溶性钙盐；
[0033]然后，称取一定量干燥后的难溶性钙盐，配置成0.05wt％的难溶性钙盐悬浊液，紫外辐射灭菌，待用；
[0034]步骤S4、制备新鲜培养基
[0035]配制目标菌株生长专用的培养基，121℃灭菌20min，得新鲜培养基，冷却后待用；
[0036]步骤S5、制备辅助菌培养基
[0037]配制辅助菌菌株生长专用的培养基，121℃灭菌20min，得辅助菌培养基，冷却后待用；步骤S6、目标菌发酵培养
[0038]将步骤S1得到的目标菌种子液接种至新鲜培养基，发酵至90％形成芽孢的稳定后期；
[0039]步骤S7、辅助菌调节pH
[0040]将步骤S2得到的辅助菌种子液离心，弃上清液，加无菌水或磷酸盐缓冲液混匀重悬，然后用0.5mol/L K2HPO4溶液调节pH至7，得辅助菌悬浮液；
[0041]步骤S8、发酵液调节pH
[0042]将步骤S6发酵至稳定后期的发酵液用0.5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种包埋微生物的微胶囊及其制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、制备种子液将目标菌株在无菌条件下转接于已灭菌的种子培养基中，置于恒温培养箱中培养，得种子液；其中，所述目标菌株为产酸菌株；步骤二、制备难溶性钙盐悬浊液称取一定量的难溶性钙盐，用蒸馏水浸泡过夜，然后用蒸馏水洗涤2～3次，烘干或自然晾干，得干燥后的难溶性钙盐；然后，称取一定量干燥后的难溶性钙盐，配置成0.05wt％的难溶性钙盐悬浊液，紫外辐射灭菌，待用；步骤三、制备新鲜培养基配制目标菌株生长专用的培养基，按0.5～5wt％的比例添加海藻酸钠，待海藻酸钠充分溶解后，121℃灭菌20min，得新鲜培养基，冷却后待用；步骤四、调整pH将步骤一中的种子液用0.5mol/L K2HPO4溶液调节pH至7；步骤五、制备含菌培养基将步骤五中调节pH后的种子液按5～10％的比例接种至步骤三制得的新鲜培养基中，添加步骤二制得的难溶性钙盐悬浊液，混匀，得含菌培养基；其中，所述难溶性钙盐悬浊液的添加量，以钙盐质量计，为新鲜培养基中海藻酸钠质量的1/2～1/5；步骤六、包埋将步骤五得到的含菌培养基置于培养箱中37℃，200rpm/min培养1～3d，待培养基中难溶性钙盐完全消失，视为发酵完成，完成目标菌的固定化，得含有微胶囊颗粒的液体制剂，该微胶囊颗粒即为所述包埋微生物的微胶囊。2.一种包埋微生物的微胶囊及其制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1、制备目标菌种子液将目标菌株在无菌条件下转接于已灭菌的种子培养基中，置于恒温培养箱中培养，得目标菌种子液；其中，所述目标菌株为无产酸能力菌株或产酸能力较弱的耐高温菌株或芽孢杆菌菌株；步骤S2、制备辅助菌种子液将辅助菌菌株在无菌条件下转接于已灭菌的培养基中，置于恒温培养箱中培养，得辅助菌种子液，待用；其中，所述辅助菌为产酸菌，且辅助菌菌株与目标菌菌株之间无拮抗作用；步骤S3、制备难溶性钙盐悬浊液称取一定量的难溶性钙盐，用蒸馏水浸泡过夜，然后用蒸馏水洗涤2～3次，烘干或自然晾干，得干燥后的难溶性钙盐；然后，称取一定量干燥后的难溶性钙盐，配置成0.05wt％的难溶性钙盐悬浊液，紫外辐射灭菌，待用；
步骤S4、制备新鲜培养基配制目标菌株生长专用的培养基，121℃灭菌20min，得新鲜培养基，冷却后待用；步骤S5、制备辅助菌培养基配制辅助菌菌株生长专用的培养基，121℃灭菌20min，得辅助菌培养基，冷却后待用；步骤S6、目标菌发酵培养将步骤S1得到的目标菌种子液接种至新鲜培养基，发酵至90％形成芽孢的稳定后期；步骤S7、辅助菌调节pH将步骤S2得到的辅助菌种子液离心，弃上清液，加无菌水或磷酸盐缓冲液混匀重悬，然后用0.5mol/L K2HPO4溶液调节pH至7，得辅助菌悬浮液；步骤S8、发酵液调节pH将步骤S6发酵至稳定后期的发酵液用0.5mol/L K2HPO4溶液调节pH至7；步骤S9、制备混合型含菌培养基向调节pH值后的发酵液中补加已灭菌的碳源，并添加海藻酸钠、难溶性钙盐悬浊液、辅助菌培养基；然后接种步骤S7制备的辅助菌悬浮液，混合均匀，得混合型含菌培养基；步骤S10、包埋将步骤S9制得的混合型含菌培养基进行厌氧搅拌发酵，待混合型含菌培养基中难溶性钙盐完全消失，视为发酵完成，完成目标菌的固定化，得含有微胶囊颗粒的发酵液；S11、杀灭辅助菌株向含有微胶囊颗粒的发酵液内添加葡萄糖氧化酶，并通过加热、保温选择性杀灭S10所得发酵液中的辅助菌株，得含有微胶囊颗粒的液体制剂，该微胶囊颗粒即为所述包埋微生物的微胶囊。3.根据权利要求2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王强锋，夏中梅，侯勇，王海涛，杨蕤兰，陈春，曾诚，
申请(专利权)人：四川省新兰月生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：