一种鼠李糖基水解酶突变体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种鼠李糖基水解酶突变体，所述鼠李糖基水解酶突变体为鼠李糖苷酶TpeRha的第513的赖氨酸发生突变；所述位点突变为具有疏水性侧链的氨基酸；所述突变体K513A、突变体K513V的水解效率分别比野生型提高2.39倍和6.27倍；本发明专利技术还公开了一种鼠李糖基水解酶突变体的制备方法；本发明专利技术还公开了改鼠李糖基水解酶突变体的应用，所述鼠李糖基水解酶突变体用于制备橙皮素

【技术实现步骤摘要】
一种鼠李糖基水解酶突变体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种鼠李糖基水解酶突变体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]橙皮素
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葡萄糖苷，分子式为C
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，是柑橘类黄酮中的其中一种成分。近年来，对橙皮素
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葡萄糖苷研究更加深入，研究结果表明，橙皮素
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葡萄糖苷的吸收时间比橙皮苷和新橙皮苷更短，生物利用度更高，且橙皮素
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葡萄糖苷在进入动物体内后，还具备益生元的特性，能促进肠道益生菌的生长，增加菌群代谢产物短链脂肪酸的含量，发挥着抗击肠炎的实际效果，起到解决肠道问题的作用。
[0003]橙皮素
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葡萄糖苷通常由橙皮苷或新橙皮苷，通过α
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鼠李糖苷酶脱掉一份子鼠李糖后形成。α
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鼠李糖苷酶能够将以醇羟基和半缩醛反应形成的糖苷键以外切或内切的方式断裂，从而效地定向水解含有鼠李糖苷的天然活性物质，例如橙皮苷。然而，α
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鼠李糖苷酶在进行规模化应用时仍然存在较大的技术壁垒，天然的α
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鼠李糖苷酶活力不足，且其反应环境往往难以满足天然酶的最优条件。

技术实现思路

[0004]为了克服现有技术的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一种鼠李糖基水解酶突变体，其能解决鼠李糖苷酶活力不足的问题。
[0005]一种鼠李糖基水解酶突变体，所述鼠李糖基水解酶突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的TpeRha酶的第513位的赖氨酸突变为具有疏水性侧链的氨基酸。
[0006]进一步地，所述具有疏水性侧链的氨基酸为丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸的其中一种。
[0007]进一步地，所述TpeRha酶第513位的赖氨酸突变为丙氨酸得到突变体K513A,氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述TpeRha酶第513位的赖氨酸突变为缬氨酸得到突变体K513V，氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
[0008]进一步地，编码所述突变体K513A基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示；编码所述突变体K513V基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
[0009]进一步地，所述TpeRha酶来源于石油热袍菌DSM 13995。
[0010]本专利技术的第二个目的在于提供一种鼠李糖基水解酶突变体的制备方法，其能解决高活力的鼠李糖苷酶制备的问题。
[0011]一种鼠李糖基水解酶突变体的制备方法，包括以下步骤：
[0012]步骤1、将待突变的TpeRha酶的编码基因连接到质粒中，得到重组质粒；
[0013]步骤2、设计并利用定点突变引物，以重组质粒为模板进行扩增，酶切后得到突变产物；所述定点突变引物对TpeRha酶的第513位的赖氨酸进行突变；
[0014]步骤3、将突变产物转化至宿主细胞中，筛选和诱导宿主细胞表达得到鼠李糖基水
解酶突变体。
[0015]进一步地，所述TpeRha酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示；所述步骤2中，TpeRha酶第513位的赖氨酸通过上游引物K513A
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F、下游引物K513A
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R突变为丙氨酸，上游引物K513A
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F核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，下游引物K513A
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R核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；TpeRha酶第513位的赖氨酸通过上游引物K513V
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F、下游引物K513V
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R突变为缬氨酸，上游引物K513V
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F核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示，下游引物K513V
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R核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。
[0016]进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌、酿酒酵母和毕赤酵母的任一种。
[0017]本专利技术的第三个目的在于提供一种鼠李糖基水解酶突变体的应用，其能解决橙皮素
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葡萄糖苷制备的问题。
[0018]一种鼠李糖基水解酶突变体的应用，所述鼠李糖基水解酶突变体用于制备橙皮素
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葡萄糖苷或橙皮素中的一种或两种的组合物。
[0019]进一步地，所述应用通过鼠李糖苷突变体催化转化橙皮苷为橙皮素
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葡萄糖苷或橙皮素中的一种或两种的组合物。
[0020]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0021]1.本专利技术的鼠李糖基水解酶突变体K513A和K513V能促进橙皮苷的水解，有效提高橙皮苷转化为橙皮素
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葡萄糖苷的效率。突变体的支链较短，不影响底物结合疏水性氨基酸。水解效率为野生型的1.1倍和1.2倍，酶解时间更短；
[0022]2.本专利技术的鼠李糖基水解酶突变体的制备方法，通过计算机辅助蛋白质工程酶分子设计手段，分析来源于石油热袍菌的α
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鼠李糖苷酶TpeRha的活性口袋区域，对其进行分子设计，再通过定点突变技术构建专用酶，制备方法精准效果好；
[0023]3.本专利技术的鼠李糖基水解酶突变体能催化转化橙皮苷制备含橙皮素
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葡萄糖苷不同含量范围组合物，应用范围广。
附图说明
[0024]图1为TpeRha酶与橙皮苷分子对接模拟图；
[0025]图2为野生型TpeRha与突变体转化橙皮苷生成橙皮素
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葡萄糖苷的水解效率结果图；
[0026]图3为全细胞催化后反应液的HPLC结果图。
具体实施方式
[0027]下面将结合具体实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的部分实施例，而不是全部实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0028]橘皮作为一种传统的药用资源，含有大量的黄酮类化合物，黄酮类化合物则是发挥橘皮抗菌，抗病毒，抗氧化等生理活性最主要的相关物质。目前已有效从橘皮中分离60多种黄酮类化合物，其中较为常见的包括新橙皮苷、橙皮苷等。新橙皮苷和橙皮苷具有广泛的应用，包括但不限于具抑制骨质疏松、降低血糖血脂及改善糖耐量、抗氧化、保护心血管、促
进胃肠道消化、抗菌、抗病毒和抗肿瘤。但本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鼠李糖基水解酶突变体，其特征在于，所述鼠李糖基水解酶突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的TpeRha酶的第513位的赖氨酸突变为具有疏水性侧链的氨基酸
。
2.根据权利要求1所述的一种鼠李糖基水解酶突变体，其特征在于，所述具有疏水性侧链的氨基酸为丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸的其中一种。3.根据权利要求1所述一种鼠李糖基水解酶突变体，其特征在于，所述TpeRha酶第513位的赖氨酸突变为丙氨酸得到突变体K513A，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述TpeRha酶第513位的赖氨酸突变为缬氨酸得到突变体K513V，氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。4.根据权利要求3所述一种鼠李糖基水解酶突变体，其特征在于，编码所述突变体K513A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；编码所述突变体K513V基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。5.根据权利要求1所述的鼠李糖基水解酶突变体，其特征在于，所述TpeRha酶来源于石油热袍菌DSM 13995。6.权利要求1
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5任一项所述的鼠李糖基水解酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、将待突变的TpeRha酶的编码基因连接到质粒中，得到重组质粒；步骤2、设计并利用定点突变引物，以重组质粒为模板进行扩增，酶切得到突变产物；其中所述定点突变引物对TpeRha酶的第513位的赖氨酸进行突变；步骤3、将突变产物转化至宿主细胞中，筛选和诱导宿主细胞表达得到鼠李糖基水解酶突变体。7.根据权利要求6所述的鼠李糖基水解酶突变体的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄佳俊，李慧灵，胡浩轩，周金林，卢宇靖，鲍雅丹，
申请(专利权)人：广东金骏康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：