一种同时检测多种支原体污染和确认支原体种类的快速检测方法、引物组及试剂盒技术

本发明专利技术采用多重荧光PCR结合CE技术(毛细管电泳)，可实现快速单次反应(3

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测多种支原体污染和确认支原体种类的快速检测方法、引物组及试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物技术检测领域，具体的为支原体检测领域，尤其涉及一种同时检测多种支原体污染并确认支原体种类的方法、引物组以及试剂盒。

技术介绍

[0002]支原体(Mycoplasma)是介于细菌和病毒之间，没有细胞壁的原核细胞型微生物。这类微生物最早是在1898年由法国的Nocard及Roux自患牛肺疫的病灶中分离出来的，1967年被正式命名为支原体。支原体由胞外结构，单位膜和胞内结构组成。其胞外结构中的荚膜和粘附结构可以帮助支原体粘附至细胞上，更有甚者可以侵入至细胞内。支原体胞内由于缺乏生物合成和代谢能力的基因，属于氨基酸、脂类和某些辅助因子营养缺陷型生物，其所需的物质更多是来源于宿主细胞和基质。
[0003]因其自身结构和代谢能力的特异性，支原体污染在细胞培养领域广泛存在。自1956年Robinson等首次从三株Hela细胞培养中分离出支原体以来，关于支原体污染细胞的报道就屡见不鲜。目前已知的支原体污染中，95％的污染源来自口腔支原体(M.orale)，精氨酸支原体(M.arginini)，发酵支原体(M.fermentans)，猪鼻支原体(M.hyorhinitis)和莱氏无胆甾原体(A.laidlawii)。
[0004]因其自身结构和代谢能力的特异性，支原体污染在细胞培养领域广泛存在。自1956年Robinson等首次从三株Hela细胞培养中分离出支原体以来，关于支原体污染细胞的报道就屡见不鲜。目前已知的支原体污染中，95％的污染源来自口腔支原体(M.orale)，精氨酸支原体(M.arginini)，发酵支原体(M.fermentans)，猪鼻支原体(M.hyorhinitis)和莱氏无胆甾原体(A.laidlawii)。
[0005]相比于支原体的污染范围，其本身带来的危害更甚。细胞是制备疫苗、抗体等生物大分子药物的主要载体之一。支原体通过引起细胞病变，竞争营养和抑制干扰素分泌等机制，产生有毒的代谢产物，从而显著影响生产用细胞的培养及相应生物技术的发挥，干扰病毒复制。这会极大影响相关生物制剂的产量，并诱导机体产生免疫反应。
[0006]现阶段对支原体检测的主要技术手段为：培养法、指示细胞染色法、NAT(核酸扩增检测)法。
[0007]培养法是通过对液体培养基的颜色、浊度变化，固体培养基和半流体培养基的支原体菌落形态来判断样本的支原体生长。其不足之处：1、周期长(一般28天)2、只适合特定支原体的生长(比如，口腔支原体、精氨酸支原体、发酵支原体等)，有可能造成漏检。3、对于交叉污染的支原体，无法识别是哪几种支原体污染。只能被动的接受细胞被污染的现状，对于污染源和风险没有更精细的质控依据。
[0008]指示细胞染色法，容易漏检。
[0009]NAT法主要基于qPCR法，其不足是对污染的支原体无法确认其种类。
[0010]对于污染支原体种类的识别无论是培养法，指示细胞染色法，还是NAT法都无法明
确确认，所以在对支原体污染防控策略上，只能依据待检样本是否污染做出相应调整，无法精准的分析。
[0011]基于上述方法在细胞支原体污染检测领域的不足，本专利技术采用多重荧光PCR结合CE技术(毛细管电泳)，可实现快速单次反应(3
‑
5小时)、且覆盖度高(通过生物信息学引物设计可实现55种支原体的特异检测)、同时确认污染支原体种类(对真实样本的检测，可确认7种支原体，经测序鉴定确认)：人源相关的口腔支原体(Mycoplasma orale)、咽支原体(Mycoplasma faucium)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans)；牛源相关的精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)、牛鼻支原体(Mycoplasma bovirhinis)；猪源的猪鼻支原体(Mycoplasma hyorinis)；鼠源的肺支原体(Mycoplasma pulmonis))。本专利技术同时对前述7种支原体的交叉污染也可以检测并区分，有利于对支原体污染来源进行溯源分析并提供质控依据。

技术实现思路

[0012]为了克服细胞支原体污染检测领域现有方法的不足，本专利技术采用多重荧光PCR结合CE技术(毛细管电泳)，可实现快速单次反应(3
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5小时)、且覆盖度高(通过生物信息学引物设计可实现55种支原体的特异检测)、同时确认污染支原体种类(对真实样本的检测，可确认7种支原体，经测序鉴定确认)：人源相关的口腔支原体(Mycoplasma orale)、咽支原体(Mycoplasma faucium)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans)；牛源相关的精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)、牛鼻支原体(Mycoplasma bovirhinis)；猪源的猪鼻支原体(Mycoplasma hyorinis)；鼠源的肺支原体(Mycoplasma pulmonis))。
[0013]本专利技术一方面是一种同时检测多种支原体污染的引物组，上述引物组的序列为：
[0014][0015][0016]本专利技术另一方面是上述引物组，通过FAM、HEX、TAMRA、ROX等任一种荧光染料标记。荧光标记的引物相比普通引物具有更优的信号放大能力，从而提升本方法的检测灵敏度，对DNA的检测限低至10pg/ul。
[0017]本专利技术另一方面是同时确认多种支原体种类的试剂盒，所述试剂盒包含7种支原体阳性质控基因片段，便于对检测结果的质控和对照解释。进一步地，本专利技术所述试剂盒为混合物，包含上述引物组mix、taq酶、PCR nucleotide mix、无核酸酶水。反应时的扩增条件为：95℃预变性2
‑
5min，1个循环；95℃变性15
‑
20s，55
‑
60℃退火60s，30
‑
35个循环。
[0018]本专利技术还有另一方面是所述的引物组或者所述的试剂盒用于检测并确认多种支原体，监测多种支原体，包括Mycoplasmopsiscynos、Mycoplasmopsisfelis、Mycoplasmopsissynoviae、Mesomycoplasmaovipneumoniae、Mycoplasmopsisarginini、
Mesomycoplasmamolare、Mycoplasma sp.、Mesomycoplasmahyorhinis、Mycoplasma iguanae、Metamycoplasmahyosynoviae、Mycoplasma salivarium、Metamycoplasma hominis、Mesomycoplasmahyopneumoniae、Mycoplasma conjunctivae、Mycoplasma anserisalpingitidis、Mycoplasmopsis pullorum、Mycopl本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测多种支原体污染和确认支原体种类的引物组，其特征在于：包括2对引物组和1对简并引物组，其引物组的序列为：Seq namesequencePrimer 1ATCTCACGATGCGAGCTGPrimer 2CCTGAGTAGTATACCGGCAAPrimer 3CTACTGCTGCCTCCCGTAPrimer 4GCTGTGTGCCTAATACATGCPrimer 5ACACCATGGYAGWTGGTAATPrimer 6CTTCYTCGACTTYCAGACCAAGGC2.权利要求1所述的引物组，其特征在于所述的引物通过FAM、HEX、TAMRA、ROX等任一种荧光染料标记检测限低至10pg/ul。3.一种同时检测多种支原体污染和确认支原体种类的扩增体系，其特征在于包含上述权利要求1或者2的引物组，扩增试剂为混合物，包含上述引物组mix、taq酶、PCR nucleotide mix、无核酸酶水。4.一种同时检测多种支原体污染和确认支原体种类的的试剂盒，其特征在于包含上述权利要求1或者2的引物组，权利要求3的扩增体系，包含7种支原体阳性质控基因片段。5.根据权利要求1所述的一种同时检测多种支原体污染和确认支原体种类的引物组，其特征是：所述检测多种支原体种类包括Mycoplasmopsiscynos、Mycoplasmopsisfelis、Mycoplasmopsissynoviae、Mesomycoplasmaovipneumoniae、Mycoplasmopsisarginini、Mesomycoplasmamolare、Mycoplasma sp.、Mesomycoplasmahyorhinis、Mycoplasma iguanae、Metamycoplasmahyosynoviae、Mycoplasma salivarium、Metamycoplasma hominis、Mesomycoplasmahyopneumoniae、Mycoplasma conjunctivae、Mycoplasma anserisalpingitidis、Mycoplasmopsis pullorum、Mycoplasmopsisgallinacea、Metamycoplasmacloacale、Mycoplasmopsisagassizii、Mycoplasma phocoenae、Mycoplasma miroungirhinis、Mycoplasma nasistruthionis、Mycoplasma zalophi、Metamycoplasmagypis、Metamycoplasmaphocicerebrale、Mycoplasma columborale、Mycoplasma citell、Mycoplasma anatis、My...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙山林，孙瑶敏，范夏萍，杨泽艳，朱莉莉，
申请(专利权)人：苏州琪霖智检细胞生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：