一种从贝莱斯芽孢杆菌分离环状脂肽BaelezcinA的方法技术

本发明专利技术公开了一种从贝莱斯芽孢杆菌分离环状脂肽Baelezcin A的方法，包括：将贝莱斯芽孢杆菌发酵，得到发酵液；将发酵液离心，收集上清液，再将上清液酸化，离心，收集沉淀；向洗涤后的沉淀加入甲醇萃取，得到脂肽粗提物AME；将AME用甲醇溶解，反向硅胶柱层析，得到AME

【技术实现步骤摘要】
一种从贝莱斯芽孢杆菌分离环状脂肽Baelezcin A的方法


[0001]本专利技术涉及化合物提起
，具体涉及一种从贝莱斯芽孢杆菌分离环状脂肽Baelezcin A的方法。

技术介绍

[0002]近些年的研究中，真菌、细菌及放线菌已被广泛用于生物防治的研究，芽孢杆菌作为优秀的生防菌脱颖而出。芽孢杆菌在自然界中普遍存在，它可以在不利条件下产生具有高度抗性的内生孢子，是重要的微生物资源，具有抑制病害、促进植株生长、繁殖能力强、刺激代谢产物多样化等优点，因此被国内外学者广泛研究。芽孢杆菌的活性次级代谢产物很多，具体是哪一种物质成分发挥作用尚不明确。

技术实现思路

[0003]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的目的在于提供一种从贝莱斯芽孢杆菌分离环状脂肽Baelezcin A的方法。
[0004]为了实现上述目的，本专利技术的实施例在提出了一种从贝莱斯芽孢杆菌分离环状脂肽Baelezcin A的方法，其包括以下步骤：
[0005](1)将贝莱斯芽孢杆菌接种至发酵培养基中发酵，得到发酵液；
[0006](2)将发酵液离心去除菌体，收集上清液，再将上清液酸化，离心，收集沉淀，洗涤沉淀；
[0007](3)向洗涤后的沉淀加入甲醇萃取，萃取3次，每次12h，合并有机相，旋转蒸发去除有机相溶剂，得到脂肽粗提物AME；
[0008](4)将脂肽粗提物AME用甲醇溶解，反向硅胶柱层析，得到提取物AME
‑
4；
>[0009](5)将提取物AME用甲醇溶解，羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，得到提取物AME
‑4‑
5；
[0010](6)将提取物AME
‑4‑
5用甲醇配置成溶液，并用高效液相色谱仪和C18柱纯化，得到化合物环状脂肽Baelezcin A。
[0011]根据本专利技术实施例的一种从贝莱斯芽孢杆菌分离环状脂肽Baelezcin A的方法，该方法简单易操作，所得到的环状脂肽Baelezcin A还未见报道，在作为生物表面活性剂、生防菌剂等方面具有潜在的活性和用途，对于微生物天然产物有效成分的研究具有十分重要的意义。
[0012]另外，根据本专利技术上述实施例提出的一种从贝莱斯芽孢杆菌分离环状脂肽Baelezcin A的方法，还可以具有如下附加的技术特征：
[0013]可选地，步骤(4)中，按照25％，50％，75％和100％甲醇的甲醇
‑
水洗脱，流速设定为10mL/min，每个体系收集5管，每管200mL；将收集的第四个体系100％甲醇组分的前两管，通过旋转蒸发去除有机相溶剂，得到提取物AME
‑
4。
[0014]可选地，步骤(5)中，设置程序为：15～20s/drop，每30min接一个试管，共接了200个试管，将200个试管切成8个组分，再将第五个组分收集，通过旋转蒸发去除有机相溶剂，
得到提取物AME
‑4‑
5。
[0015]可选地，步骤(6)中，进样量为100μL，采用1mL/min的66.0％乙腈水，加0.1％三氟乙酸洗脱，用210nm波长检测；收集33～37min的大峰，得到化合物环状脂肽Baelezcin A。
[0016]可选地，步骤(1)中，发酵培养72h。
[0017]可选地，步骤(2)中，酸化为向上清液中加入6mol/L的HCl调节pH值至2，酸化处理24h。
[0018]本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。
附图说明
[0019]图1为根据本专利技术实施例的化合物的高效液相色谱图；
[0020]图2为根据本专利技术实施例的Baelezcin A的ESI
‑
MS谱；
[0021]图3为根据本专利技术实施例的Baelezcin A的化学结构和关键二维核磁共振关联；
[0022]图4为根据本专利技术实施例的Baelezcin A的红外光谱；
[0023]图5为根据本专利技术实施例的Baelezcin A对灰葡萄孢菌生长的影响。
具体实施方式
[0024]以下通过特定的具体实例说明本专利技术的技术方案。应理解，本专利技术提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本专利技术可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更
技术实现思路
的情况下，当亦视为本专利技术可实施的范畴。
[0025]为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本专利技术的示例性实施例。虽然显示了本专利技术的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本专利技术而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本专利技术，并且能够将本专利技术的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0026]本专利技术采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0027]其中，贝莱斯芽孢杆菌，拉丁文名称为Bacillus velezensis，于2020年07月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20398，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0028]下面参考具体实施例，对本专利技术进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本专利技术。
[0029]实施例从贝莱斯芽孢杆菌分离环状脂肽Baelezcin A
[0030]1)使用振荡培养箱(ZQZY
‑
BF9.9，上海知楚仪器)在37℃，200rpm下摇瓶发酵培养72h，将10L发酵好的贝莱斯芽孢杆菌发酵液在12000rpm，4℃下离心10min去除菌体，向上清液中加入6mol/L的HCl调节pH值至2。24h后，将酸化的上清液在同样的条件下离心，并收集底部沉淀。
[0031]2)将沉淀用无菌蒸馏水洗涤后，加入100％甲醇萃取，萃取3次，每次12h，合并有机
相，旋转蒸发去除有机溶剂，获得脂肽粗提物(AME)2.2097g。
[0032]3)将脂肽粗提物用25％甲醇(甲醇:水＝1:3，v/v)(溶解，用反向硅胶柱层析(慧德易制备型高效液相色谱仪QuikSep P0100；玻璃柱：25cm
×
Φ5cm，柱床体积约500mL；填料：YMC*GEL ODS
‑
A
‑
HG，50μm)制备，甲醇—水体系洗脱(25％，50％，75％和100％甲醇)，流速设定为10mL/min，每个体系收集5管，每管200mL；将收集的第四个体系100％甲醇组分的前两管，通过旋转蒸发去除有机相溶剂，得到AME
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从贝莱斯芽孢杆菌分离环状脂肽Baelezcin A的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将贝莱斯芽孢杆菌接种至发酵培养基中发酵，得到发酵液；(2)将发酵液离心去除菌体，收集上清液，再将上清液酸化，离心，收集沉淀，洗涤沉淀；(3)向洗涤后的沉淀加入甲醇萃取，萃取3次，每次12h，合并有机相，旋转蒸发去除有机相溶剂，得到脂肽粗提物AME；(4)将脂肽粗提物AME用甲醇溶解，反向硅胶柱层析，得到提取物AME
‑
4；(5)将提取物AME用甲醇溶解，羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，得到提取物AME
‑4‑
5；(6)将提取物AME
‑4‑
5用甲醇配置成溶液，并用高效液相色谱仪和C18柱纯化，得到化合物环状脂肽Baelezcin A。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，按照25％，50％，75％和100％甲醇的甲醇
‑
水洗脱，流速设定为10mL/...

【专利技术属性】
技术研发人员：李健，袁自强，张倩，包汶婷，孟瑜，
申请(专利权)人：山东省果树研究所，
类型：发明
国别省市：