一种红斑狼疮小鼠模型的构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种红斑狼疮小鼠模型的构建方法及应用，所述红斑狼疮小鼠模型的构建方法通过巨噬细胞条件性敲除RCP基因的方式构建红斑狼疮小鼠模型。本发明专利技术构建所得红斑狼疮小鼠有助于红斑狼疮得到机理研究，以及有助于制备和/或筛选治疗红斑狼疮药物。备和/或筛选治疗红斑狼疮药物。备和/或筛选治疗红斑狼疮药物。

【技术实现步骤摘要】
一种红斑狼疮小鼠模型的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于小鼠模型
，具体涉及一种红斑狼疮小鼠模型的构建方法及应用。

技术介绍

[0002]系统性红斑狼疮(SLE)作为自身免疫疾病的原型，可累及全身多个器官及系统。SLE具有一定异质性，轻型患者可表现为关节痛，重型患者可出现心、脑、肾等靶器官损害，严重时甚至可以危及生命。已有报道，SLE的发病率在每10万人中有40
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50人。并且，90％的SLE患者是育龄期女性，不仅影响个人的健康，对于家庭和社会造成很大的负担。
[0003]目前已有用于研究SLE发病机制和新的治疗方法的两种小鼠模型，包括新西兰黑
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白F1小鼠(NZB/W)、Murphy Roths Large/Lpr小鼠(MRL/LPR)和BXSB/Yaa小鼠。
[0004]NZB/NZW F1鼠是NZB老鼠和NZW老鼠交配后的第一代老鼠，自发出现狼疮表型，其亲代任一方均不发生病变。由Helyer在1963年发现。该模型小鼠4
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5月开始发病，5
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6月出现明显的肾小球肾炎的症状，10
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12月进展为严重的狼疮，因肾衰竭而死。此类小鼠发病症状与人类相似，性激素对该鼠有明显的影响，雌鼠比雄鼠起病早且严重。特征是高滴度anti
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dsDNA，anti
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ssDNA抗体，高丙种球蛋白血症。
[0005]MRL/lpr鼠模拟的是T细胞凋亡缺陷导致的功能异常，以淋巴、脾脏肿大为特点，这两种器官含有大量淋巴细胞，因此，该模型主要模拟了适应性免疫系统异常。而先天免疫系统正常，例如：IFN
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alpha不升高。尽管MRL/lpr鼠表现出anti
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dsDNA抗体升高，蛋白尿，和低补体血症，但并不完全符合人类疾病的特点。例如狼疮主要以育龄期女性发病，男女比例为1:9，而MRL/lpr模型没有表现出性别差异。NZB/NZW F1小鼠，表现狼疮表型的原因不明，且发病周期长(6个月)，易受环境因素影响，且实验过程不易控制，为研究疾病的发病机制带来困难。
[0006]既往报道，SLE患者体内产生大量凋亡细胞(apoptotic cell，AC)，但不能被及时清除，导致自身抗原增多，从而引发自身抗体的产生。巨噬细胞吞噬凋亡细胞的过程，称为胞葬作用(efferocytosis)。巨噬细胞作为发生胞葬作用的主力军，其胞葬功能异常，可能是SLE的发病机制之一。Luo等发现巨噬细胞促红细胞生成素受体(EPOR)条件性敲除小鼠中，巨噬细胞胞葬作用下降，可以导致该小鼠出现抗核抗体升高，抗双链DNA抗体升高，尿蛋白增加等狼疮样表现。此外，微管相关蛋白1轻链3(LC3)相关吞噬通路上的NADPH氧化酶2(NOX2)被敲除后，小鼠也可以出现狼疮样表现。说明巨噬细胞胞葬功能异常，可能是SLE重要的发病机制。
[0007]RAB11FIP1是Rab11家族相互作用蛋白的成员，也可以称为Rab结合蛋白，即RCP。RCP通过C端的α螺旋与Rab11结合，此区域称为Rab11结合区域(Rab binding domain，RBD)。除此以外，RCP还可以与Rab14和Rab25相结合。RCP在其N端为C2区域，在C2区域与RBD之间，还有富集脯氨酸，谷氨酸，丝氨酸/苏氨酸的结构，这个结构可以与钙蛋白酶结合，从而降解RCP。RCP可位于细胞膜和细胞质，在细胞膜上分为胞外段和胞内段。RCP作为调控细胞内运
输的关键蛋白，装载“货物”而发挥作用，可以转运上皮细胞生长因子受体(EGFR)与整合素α5β1，增强肿瘤的侵袭和转移。此外，RCP与巨噬细胞吞噬功能相关，与内吞小体的转运和循环有关。
[0008]因此，若能构建一种RCP基因特异性敲除的小鼠模型，有助于科研工作者及临床医生更好的了解红斑狼疮的发病机制，及靶向红斑狼疮的药物研发中的应用。

技术实现思路

[0009]本专利技术提供了一种红斑狼疮小鼠模型的构建方法，构建所得红斑狼疮小鼠有助于红斑狼疮得到机理研究，以及有助于制备和/或筛选治疗红斑狼疮药物。
[0010]本专利技术第一方面提供了一种红斑狼疮小鼠模型的构建方法，通过巨噬细胞条件性敲除RCP基因的方式构建红斑狼疮小鼠模型。
[0011]本专利技术的一实施例中，通过巨噬细胞条件性敲除RCP基因的方式构建红斑狼疮小鼠模型，包括以下步骤：
[0012]S1、通过基因打靶技术构建Rab11fip1基因特异性敲除的打靶载体；
[0013]S2、打靶载体电转至供体小鼠的ES细胞中，通过正负筛选挑选和PCR鉴定阳性ES细胞；
[0014]S3、将阳性ES细胞注射入供体小鼠的囊胚中,将注射后的囊胚移植到假孕母鼠体内，生产出小鼠，即为F0代小鼠，提取F0代小鼠尾部DNA，并进行基因型鉴定；
[0015]S4、鉴定得到的阳性小鼠与同品系的野生型小鼠配种获得F1小鼠；此时获得F1小鼠为flox杂合子；经PCR鉴定得到的阳性F1小鼠互配后得到F2小鼠，F2代小鼠有25％的概率可以获得flox纯合小鼠。
[0016]S5、将F2代flox杂合子小鼠与Lyz2
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Cre工具小鼠交配获得的F3代小鼠，PCR鉴定得到基因型为CKO杂合子小鼠，CKO杂合子小鼠与flox纯合小鼠配种传代获得PCR鉴定的CKO纯合小鼠即为Rab11fip1基因特异性敲除的小鼠模型。
[0017]本专利技术的一实施例中，所述供体小鼠为C57BL/6N小鼠。
[0018]本专利技术第二方面提供了一种红斑狼疮小鼠模型，根据上述构建方法构建得到。
[0019]本专利技术第三方面提供了通过上述红斑狼疮小鼠模型的构建方法得到的红斑狼疮小鼠模型在红斑狼疮的机理研究方面的应用。
[0020]本专利技术第四方面提供了通过上述红斑狼疮小鼠模型的构建方法得到的红斑狼疮小鼠模型在制备和/或筛选治疗红斑狼疮药物中的应用。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：本专利技术实施例提供的红斑狼疮小鼠模型的构建方法，构建所得红斑狼疮小鼠有助于红斑狼疮得到机理研究，以及有助于制备和/或筛选治疗红斑狼疮药物。
[0022]说明书附图
[0023]图1为本专利技术中小鼠基因型鉴定策略图。F1/R1与F2/R2鉴定flox/+基因型；
[0024]图2为F1/R1引物对扩增胶图鉴定loxP位点图；Clone:1H8(WT:213bp；MT:253bp)；图2中数字表示小鼠编号；WT代表野生型；M代表标尺。Water代表水；ESC代表胚胎干细胞；
[0025]图3为F2/R2引物对扩增结果图，鉴定Neo deletion位点；Clone:1H8(WT:195bp；MT:318bp)。上面的数字表示小鼠编号；WT代表野生型；M代表标尺；Water代表水；
[0026]图4为Rab11fip1[flox/flox],Lyz2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种红斑狼疮小鼠模型的构建方法，其特征在于，通过巨噬细胞条件性敲除RCP基因的方式构建红斑狼疮小鼠模型。2.根据权利要求1所述的红斑狼疮小鼠模型的构建方法，其特征在于，通过巨噬细胞条件性敲除RCP基因的方式构建红斑狼疮小鼠模型，包括以下步骤：S1、通过基因打靶技术构建Rab11fip1基因特异性敲除的打靶载体；S2、打靶载体电转至供体小鼠ES细胞中，通过正负筛选挑选，和PCR鉴定及Southern Blot分析获得阳性ES细胞；S3、将阳性ES细胞注射入供体小鼠的囊胚中,将注射后的囊胚移植到假孕母鼠体内，生产出小鼠，即为F0代小鼠，提取F0代小鼠尾部DNA，并进行基因型鉴定；S4、鉴定得到的阳性小鼠与同品系的野生型小鼠配种获得F1小鼠；此时获得得F1小鼠为flox杂合子；经PCR鉴定得到的阳性F1小鼠互配后得到F2小鼠，F2代小鼠有25％的概率可以获得flox纯合小鼠；S5、将F...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶俊娜，周卓超，游懿君，孙悦，王凡，杨程德，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属瑞金医院，
类型：发明
国别省市：