一种基于CRISPR/Cas12a检测单增李斯特菌的现场可视化试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR/Cas12a检测单增李斯特菌的现场可视化试剂盒及应用，所述试剂盒包含RPA扩增试剂和CRISPR/Cas12a检测试剂。本发明专利技术还公开了一种使用所述的现场可视化试剂盒检测单增李斯特菌的方法，所有试剂放在同一离心管中进行检测，操作简单，避免了样品及环境污染。利用本发明专利技术的试剂盒及检测方法进行单增李斯特菌的检测，可以实现37℃条件下恒温检测，大幅降低RPA反应体积，可以实现在25分钟内对4.4CFU/g的细菌检测，结果实现可视化。本发明专利技术的方法具有降低RPA体系损耗，扩增体系与检测体系完全分离、避免交叉污染、结果可视化等优点。视化等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR/Cas12a检测单增李斯特菌的现场可视化试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及一种用于检测单增李斯特菌的CRISPR/Cas12a现场可视化试剂盒及应用，属于分子生物学诊断


技术介绍

[0002]单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes),简称单增李斯特菌，是重要的食源性致病菌，其在低温下的耐受性和生长能力是该病原体的显著特征之一。这种病原体可在许多物体表面形成生物膜且不易清除，在4℃环境中也能生长，是冷藏食品的主要污染菌。人类李斯特菌病是由食用被单核增生李斯特菌污染的食品引起的。大多数人摄入高度污染的食物可导致轻至严重的胃肠炎，症状包括腹泻、腹痛、发烧、呕吐、轻微和流感样疾病。
[0003]目前我国对单增李斯特菌的检测包括细菌学、免疫学和分子生物学。细菌学是金标准但费时费力、免疫学检测对非富集食品病原菌检测灵敏度不高。而单增李斯特菌在食品中的浓度极低，对于检测技术的灵敏度有较高要求。随着分子生物学技术的发展，包括PCR、LAMP、RPA在内的核酸扩增方法逐步用于单增李斯特菌的鉴定。但现有分子生物学技术对仪器要求高，或者在操作中易污染、样品处理复杂等问题，而且扩增产物需要通过琼脂糖凝胶电泳或荧光定量检测等设备才能得到检测结果，无法达到现场可视化。
[0004]近年来，基于CRISPR系统的基因编辑技术炙手可热。CRISPR本是细菌体内的自适应性免疫系统，当再次受到外来微生物入侵时，CRISPR可对其进行识别，并通过crRNA激活相应Cas蛋白分解入侵者的DNA或RNA。CRISPR/Cas12a受单链RNA(crRNA)引导，特异性结合靶DNA后，Cas12a的结构变化导致其酶活性，不仅可以顺式切割靶标DNA，还可以反式切割非靶标DNA。2018年，Jennifer Doudna团队利用CRISPR/Cas12a的特性并结合等温扩增建立了DETECTR((DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter)，并在文章中报道了检测了患者的人乳头瘤病毒(HPV)。检测高效、低廉、操作简单、省时省力。上述优势使得CRISPR/Cas12a方法可以用于基层普通实验室或野外进行单增李斯特菌的快速检测和诊断。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一在于提供一种基于CRISPR/Cas12a检测单增李斯特菌的现场可视化试剂盒及其应用。
[0006]本专利技术的目的之二在于提供一种使用上述试剂盒检测单增李斯特菌的方法。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]本专利技术的一种基于CRISPR/Cas12a检测单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)的现场可视化试剂盒，所述的现场可视化试剂盒包含以下组分：RPA扩增试剂和CRISPR/Cas12a检测试剂；
[0009]其中，所述RPA扩增试剂中包括RPA扩增引物对，所述的RPA扩增引物对由SEQ ID No.1所示的上游引物和SEQ ID No.2所示的下游引物组成；
[0010]其中，所述CRISPR/Cas12a检测试剂中包括LbCas12a，crRNA，NEBuffer3.1以及ssDNA荧光报告物，所述的crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011]其中，优选的，所述的RPA扩增试剂中还包括RPA Basic冻干粉，RPA反应缓冲液，MgOAc以及DEPC水。
[0012]进一步的，本专利技术还提出了所述的现场可视化试剂盒在检测单增李斯特菌中的应用。
[0013]其中，优选的，所述的现场可视化试剂盒用于检测食品或环境中存在的单增李斯特菌。
[0014]更进一步的，本专利技术还提出了一种使用所述的现场可视化试剂盒检测食品或环境中存在的单增李斯特菌的方法，包括以下步骤：
[0015](1)采用水煮法提取单增李斯特菌中的基因组DNA；
[0016](2)在离心管底部放置所述RPA扩增试剂和所述基因组DNA，在离心管盖上放置CRISPR/Cas12a检测试剂；
[0017](3)进行RPA扩增15分钟；
[0018](4)离心5秒，将所述离心管中全部试剂混匀，进行CRISPR/Cas12a检测；
[0019](5)10分钟后检测和观察荧光信号。
[0020]其中，优选的，步骤(3)中，RPA扩增的反应体系包含：0.4mg RPA Basic冻干粉，10μM上下游引物各0.24μL，RPA反应缓冲液2.95μL，280mM MgOAc0.25μL，0.2μL基因组DNA以及DEPC水补足至5μL反应体系，反应条件：37℃扩增15分钟。
[0021]其中，优选的，步骤(4)中，所述CRISPR/Cas12a检测体系包含：1μM LbCas12a 2μL，1μM crRNA 2μL，NEBuffer3.13μL，5μM ssDNA荧光报告物2μL以及DEPC水16μL，反应温度为37℃，反应时间为10分钟。
[0022]其中，优选的，步骤(5)中在470～520nm波长的蓝光透射仪下观察反应体系产生的荧光情况。
[0023]其中，优选的，所述单增李斯特菌浓度最低检测限为4.4CFU/g。
[0024]相较于现有技术，本专利技术的有益效果是：
[0025]本专利技术提供了一种基于CRISPR/Cas12a检测单增李斯特菌的现场可视化试剂盒；也提供了一种使用所述的现场可视化试剂盒检测单增李斯特菌的方法。本专利技术将CRISPR/Cas12a检测试剂与RPA扩增试剂在同一离心管中完全分离使两个反应互不影响，RPA反应15分钟后再离心，共计在25分钟内实现4.4CFU/g的检测灵敏度。本专利技术不需要昂贵的设备，并且大幅减少了诊断的成本和时间进行现场检测。本专利技术的引物组具有特异性强、敏感性好，所专利技术的试剂盒具有大幅度降低RPA体系损耗，扩增体系与检测体系完全分离、反应时间大大缩短、结果可视化等优点。使得本专利技术建立的CRISPR/Cas12a方法可以用于单增李斯特菌的现场可视化检测，从而有利于在基层和野外工作中进行推广，降低消费者感染风险。
附图说明
[0026]图1为本专利技术提供的CRISPR/Cas12a检测单增李斯特菌的原理图；
[0027]图2为本专利技术提供的针对单增李斯特菌的特异性PCR引物的筛选结果图(P表示阳性对照，N表示阴性对照)；
[0028]图3为本专利技术提供的针对单增李斯特菌的特异性RPA引物的筛选结果(P表示阳性对照，N表示阴性对照)；
[0029]图4为本专利技术提供的RPA体积优化结果；
[0030]图5为本专利技术提供的crRNA筛选结果图；
[0031]图6为本专利技术提供的不同食源性致病菌进行的特异性检测的终点荧光柱形图和可视化结果图；柱形图中，从左到右分别为单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)，致病性小本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas12a检测单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)的现场可视化试剂盒，其特征在于，所述的现场可视化试剂盒包含以下组分：RPA扩增试剂和CRISPR/Cas12a检测试剂；其中，所述RPA扩增试剂中包括RPA扩增引物对，所述的RPA扩增引物对由SEQ ID No.1所示的上游引物和SEQ ID No.2所示的下游引物组成；其中，所述CRISPR/Cas12a检测试剂中包括LbCas12a，crRNA，NEBuffer3.1以及ssDNA荧光报告物，所述的crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.如权利要求1所述的现场可视化试剂盒，其特征在于，所述的RPA扩增试剂中还包括RPABasic冻干粉，RPA反应缓冲液，MgOAc以及DEPC水。3.权利要求1或2所述的现场可视化试剂盒在检测单增李斯特菌中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的现场可视化试剂盒用于检测食品或环境中存在的单增李斯特菌。5.一种使用权利要求1或2所述的现场可视化试剂盒检测食品或环境中存在的单增李斯特菌的方法，包括以下步骤：(1)采用水煮法提取单增李斯特菌中的基因组DNA；(2)在离心管底部放...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢士英，肖毅然，任洪林，李香荷，王菡，胡盼，李岩松，柳增善，王聪，郭禹汐，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：