一株土荆芥种子内生拉里摩尔土壤杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株土荆芥种子内生拉里摩尔土壤杆菌（Agrobacterium larrymoorei）HLF14，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.26648；该菌株具有较强的解磷和产IAA能力，具有固氮和耐镉的能力，在镉胁迫下，接种HLF14，能够显著促进植物生长，增强其镉抗性，在植物

【技术实现步骤摘要】
一株土荆芥种子内生拉里摩尔土壤杆菌及其应用


[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及一株种子内生细菌拉里摩尔土壤杆菌（Agrobacterium larrymoorei）HLF14及其在促进植物生长和重金属污染修复中的应用。

技术介绍

[0002]随着人类工农业现代化的发展，矿山开采与冶炼、化肥农药的使用、农田污灌等人类活动造成的土壤重金属污染越来越严重。重金属具有生物蓄积性、沿食物链传递性，严重威胁农业生产、食品安全以及人类健康。目前土壤重金属污染问题中，镉污染最为突出，土壤中的镉具有较强的迁移性，易于被粮食作物吸收并富集，2014年的《全国土壤污染状况调查公报》指出，我国土壤总超标率为16.1%，其中镉超标率占7.0%。因此，土壤重金属污染的修复受到社会各界广泛关注。
[0003]在所有修复方法中，植物修复主要是通过种植超累积植物来富集土壤中的重金属，与传统的理化方法相比，具有成本低、环保且简单高效等优点。然而，在实际应用中，植物修复通常受限于超累积植物生长缓慢、土壤重金属类型及形态等，单独使用植物修复土壤重金属污染时效较长、效率较低。因此提高植物修复效率成为研究的重点，内生菌可通过多种途径定殖于植物中，通过生物固氮、解磷、产生植物激素等多种途径促进植物生长，还可以增强植物对重金属的抗性和富集能力。例如Liu等人研究发现镉超累积植物商陆内生蜡样芽孢杆菌PE31具有优异的产IAA和铁载体、解磷、抗镉等能力，接种PE31显著提高了土壤有效钾、磷、有机质等养分物质含量，进而提高了商陆的生物量和组织中的镉含量。内生菌
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植物联合修复技术可以有效地提高植物对土壤中重金属的修复效率，具有较好地应用前景。
[0004]作为植物的繁殖器官，种子内定殖有一定数量的内生菌。研究表明，部分种子内生菌可以垂直传播给下一代植物，重金属胁迫下，这些种子内生菌可以促进植物生长、增强宿主植物的重金属抗性和吸收富集。例如Truyens等发现镉/镍污染稻田中禾草细弱剪股颖的种子内生芽孢杆菌属细菌具有较强的产铁载体、IAA等能力，能够显著促进细弱剪股颖幼苗，增强其镉抗性；同样Li等人从烟草种子中分离出具有固氮、解磷、产IAA、耐受重金属等特性的假单胞菌K03、K04和N05，均可促进铅污染土壤中烟草的生长，提高了根系的酶活性。因此，污染环境中超累积植物种子内生菌，在提高植物
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微生物修复中具有广阔的应用前景。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一株种子内生细菌HLF14，其分离自超累积植物土荆芥（Dysphania ambrosioides L.）种子，分类命名为拉里摩尔土壤杆菌（Agrobacterium larrymoorei），于2023年2月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26648，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0006]本专利技术另一目的是提供上述种子内生细菌拉里摩尔土壤杆菌HLF14的新用途，即
将其应用在促进植物生长和镉污染的生物修复中，本专利技术种子内生细菌拉里摩尔土壤杆菌HLF14具有固氮、耐镉能力、较强的解磷和产IAA能力，在镉胁迫下能够促进宿主植物的生长、增强其镉抗性。
[0007]为了实现以上目的，本专利技术采取以下技术方案：1、将采集自云南省曲靖市会泽县者海镇阿依卡村重金属污染区矿渣堆上的超累积植物土荆芥（D. ambrosioides）的植物样品置于阳光下晾晒风干至种子自然脱落，然后将种子样品置于4℃冰箱中保存备用；2、准确称取1g种子，用自来水清洗干净，表面消毒后，置于无菌滤纸上吸干水分；将表面消毒后的种子混合无菌石英砂研磨成粉末，与9mL无菌水充分混合，混合液梯度稀释后涂布于LB培养基上，37℃培养10天，隔天观察，见有菌落长出则挑取，分离纯化后获得多株内生细菌菌株，并将内生细菌菌株制成菌悬液；3、将分离得到的内生菌株接种到NBRIP固体培养基上，以水解圈判定菌株的解磷能力；4、选出溶磷能力较强的菌株保存于LB斜面上备用，并将该细菌菌株命名为HLF14；5、菌株HLF14的鉴定（1）菌株HLF14形态学特征：在LB培养基上菌落呈乳白色圆形凸起，边缘整齐，表面湿润光滑，革兰氏染色为阴性，菌体呈杆状，无芽孢；（2）分子鉴定：采用MoBio PowerSoil
® DNA试剂盒提取该菌株总DNA，经检测后送测序公司进行序列测定，将测序结果与NCBI上序列进行比对；结合形态学特征和分子鉴定结果，最终将该菌株鉴定为拉里摩尔土壤杆菌（Agrobacterium larrymoorei）；该菌株保存和活化所用培养基均为LB培养基；6、本专利技术将从土荆芥中分离得到的种子内生细菌拉里摩尔土壤杆菌HLF14进行盆栽试验，探讨其对玉米生长和抗镉胁迫的影响，即在镉胁迫下，进行了接种种子内生细菌拉里摩尔土壤杆菌HLF14对玉米生长的影响研究，为种子内生菌
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植物联合修复提供细菌菌种和理论研究依据。
[0008]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供的种子内生细菌拉里摩尔土壤杆菌HLF14来源于超累积植物土荆芥，其具有固氮、耐镉能力、较强的解磷和产IAA能力，且通过简单液体发酵即可获得大量的菌悬液，菌体易获取，成本低廉，拥有商业化应用的潜能；接种菌株HLF14能够明显促进镉胁迫下宿主植物的生长、提高其生存能力、增强其镉抗性，对重金属污染土壤的修复有重要意义。
附图说明
[0009]图1为种子内生细菌拉里摩尔土壤杆菌HLF14在LB培养基上的菌落形态；图2为种子内生细菌拉里摩尔土壤杆菌HLF14革兰氏染色照片；图3为磷标准溶液的标准工作曲线；图4为拉里摩尔土壤杆菌HLF14解磷能力测定结果；图5为拉里摩尔土壤杆菌HLF14固氮能力测定结果图6为IAA标准溶液的标准工作曲线；
图7为拉里摩尔土壤杆菌HLF14产IAA能力测定结果；图8为拉里摩尔土壤杆菌HLF14镉耐受能力测定结果图9为镉胁迫下，接种（E+）和未接种（E
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）拉里摩尔土壤杆菌HLF14对玉米生长的影响结果。
具体实施方式
[0010]下面结合具体实施例和附图对本专利技术的技术方案做进一步详细说明，但本专利技术并不局限于以下技术方案。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。本领域的普通技术人员可以参照本专利技术申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施；实施例1：种子内生细菌拉里摩尔土壤杆菌HLF14的分离、筛选与鉴定（1）采集自云南省曲靖市会泽县者海镇阿依卡村重金属污染区矿渣堆上的超累积植物土荆芥（D. ambrosioides）的植物样品置于阳光下晾晒风干至种子可以自然脱落，然后将种子样品置于4℃冰箱中保存备用；（2）准确称取1g种子，用自来水清洗干净，按下列程序进行表面消毒：体积浓度75%的乙醇漂洗2次，每次时间为2min，无菌水冲洗5次，置于无菌滤纸上吸干水分；将表面消毒后的种子混合无本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株土荆芥种子内生拉里摩尔土壤杆菌（Agrobacteriumlarrymoorei）HLF14，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.26648。2.权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李海燕，龚伟军，高馨竹，韩雪，毛文沁，汤雯婷，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：