多杀性巴氏杆菌arcA基因及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及多杀性巴氏杆菌arcA基因及其应用，所述多杀性巴氏杆菌的arcA基因的基因编号为A0R64_00400，所述A0R64_00400的序列如SEQ IDNO：1所示。本发明专利技术首次筛选得出了多杀性巴氏杆菌的arcA基因同源物，发现其编码序列与其他细菌的ArcA具有较高的同源性，并通过自杀质粒介导的同源重组法构建菌株，在鸭模型上证实该缺失株高度减毒，证实A0R64_00400为多杀性巴氏杆菌的arcA基因，也为毒力基因。本发明专利技术构建的arcA、gatA双基因突变株，在鸭上高度减毒并具备一定的体内定殖水平，且不影响鸭群的生产性能，具备减毒活疫苗潜力。活疫苗潜力。活疫苗潜力。

【技术实现步骤摘要】
多杀性巴氏杆菌arcA基因及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及多杀性巴氏杆菌arcA基因及其应用。

技术介绍

[0002]多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)是一种重要的畜禽病原菌，隶属于巴氏杆菌科、巴氏杆菌属多杀亚种。它的宿主谱广泛，可引起多种动物如鸭、鸡、牛、猪的接触性传染病，在禽类上表现为禽霍乱。根据其脂多糖(LPS)外核心寡糖基因簇可分为8种LPS型(L1
‑
L8)，引发禽霍乱的多为L1型。目前预防该病的商品化疫苗主要为油乳剂灭活疫苗，然而其存在免疫剂量大、副作用明显、交叉保护力弱等缺陷。基因工程减毒活疫苗具有基因背景明确、可口服或滴鼻、诱导均衡免疫反应、交叉保护力强等优势，是理想的疫苗形式。
[0003]筛选合适的毒力基因是构建基因工程减毒活疫苗的前提。细菌入侵机体后会遭遇多种极端环境，如氧化应激、缺铁、缺氧、低酸等，适应这些变化对细菌生存十分重要。研究发现，与细菌适应极端环境相关的调控因子往往与细菌毒力密切相关。基于大肠杆菌、流感嗜血杆菌等革兰氏阴性菌的研究证实，全局调控因子ArcA(Aerobic respiratory control)在多种细菌适应有氧、无氧环境及其转换中发挥重要作用，在部分细菌中其与毒力有一定影响；然而此基因及其功能在多杀性巴氏杆菌中仍是未知的。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种多杀性巴氏杆菌arcA基因及其应用。
[0005]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：多杀性巴氏杆菌的arcA基因，所述多杀性巴氏杆菌的arcA基因的基因编号为A0R64_00400，所述A0R64_00400的序列如下：
[0006]ATGGGAACGCCACAAATTTTAATTGTTGAAGACGAAGCAATCACCAGAAATACCTTAAAAAGTATTTTTGAGGCGGAGGGTTATGAAGTATTTGAGGCGGCAGACGGCGCACAGATGCACCGTATTCTGTCTAATAAAGTGATTAATCTTGTCATTATGGATATCAACTTACCCGGTAAGAATGGACTCATGCTCGCCCGCGAACTACGAGAAACGACCAATACCGCATTAATGTTTTTAACTGGTCGCGATAATGAAGTGGATAAAATTCTTGGTCTAGAAATCGGTGCGGATGATTACATCACAAAACCATTCAATCCAAGAGAATTAACCATTCGTGCACGAAATTTATTACAACGCACGATGCAAGAAAATAGTAAAGATAGCCATCATCCTATTGAGCAATATCGCTTTAATGGCTGGACACTAGACTTAAATAGCCGCACGTTAATTAATCCAGAAGGGGAAGAATATAAACTTCCACGCAGTGAATTCCGTGCGATGTTACATTTCTGTGAAAACCCGGGCAAAATTCAAACCCGTGAAGAATTATTGAAGAAAATGACGGGACGTGAATTAAAGCCACAAGATCGGACAGTAGATGTCACTATTCGTCGTATTCGTAAACATTTTGAAGATCATCCAGAAACCCCAGAGATTATCGCCACGATCCATGGTGAAGGTTATCGTTTCTGTGGTGAATTAGAATAA
[0007]本专利技术通过Blast方法筛选到多杀性巴氏杆菌的arcA基因同源物，发现其编码序列与其他细菌的ArcA具有较高的同源性。然后，通过自杀质粒介导的同源重组法构建了多杀性巴氏杆菌L1型菌株的arcA基因缺失株，在鸭模型上证实该缺失株高度减毒，表明arcA为多杀性巴氏杆菌的毒力基因。
[0008]本专利技术还提供一种上述的arcA基因用于多杀性巴氏杆菌减毒的应用。
[0009]进一步的，所述应用的方法包括：通过自杀质粒介导同源重组法构建缺失arcA基因的多杀性巴氏杆菌。
[0010]进一步的，所述应用的方法具体包括：
[0011]S1、构建缺失arcA基因的自杀质粒；
[0012]S2、将步骤S1构建好的自杀质粒转入感受态大肠杆菌后与多杀性巴氏杆菌进行接合转移，筛选阳性菌落；
[0013]S3、通过PCR筛选得到缺失arcA基因的多杀性巴氏杆菌。
[0014]进一步的，步骤S1中，构建缺失arcA基因的自杀质粒方法包括：
[0015]1)根据多杀性巴氏杆菌和质粒的序列信息，设计引物分别扩增arcA的上游和下游同源臂，以及扩增同源臂之间的卡那霉素抗性基因片段，抗性基因片段与arcA基因的上游和下游同源臂片段分别有15
±
2bp的重复序列；
[0016]2)以多杀性巴氏杆菌全基因组为模板扩增arcA上游和下游同源臂，以质粒为模板，扩增卡那霉素抗性基因；
[0017]3)将步骤2)扩增得到的产物采用引物和高保真酶进行PCR扩增，得到融合片段；
[0018]4)将质粒进行酶切后，与融合片段进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞中，进行PCR鉴定，获得阳性缺失arcA基因的自杀质粒。
[0019]进一步的，所述自杀质粒介导同源重组法中涉及到的引物如SEQ ID NO：2
‑
SEQ ID NO：13所示。
[0020]缺失两个或以上毒力基因可大幅降低突变株毒力返强的几率，确保疫苗株的安全性，为构建基因工程减毒活疫苗的有效策略。前期研究证实，L1型多杀性巴氏杆菌LPS外核心寡糖为多杀性巴氏杆菌的毒力因子，缺失其合成相关糖基转移酶hptE或gatA可降低细菌在鸡上的毒力；然而由于相关突变株是通过单交叉插入的方法构建，其菌株在体内转化为野生型回复株。本专利技术通过自杀质粒介导同源重组法构建了稳定的gatA突变株，并证实其在鸭上高度减毒。
[0021]本专利技术在多杀性巴氏杆菌野生株PM0818上构建了arcA、gatA双基因突变株(ΔgatAΔarcA)，检测其在鸭上的毒力和免疫保护潜力，证实该突变株具有高安全性，并提供良好的针对多杀性巴氏杆菌强毒株的免疫保护效力。
[0022]所述方法包括：通过自杀质粒介导同源重组法构建缺失arcA基因、gatA基因的多杀性巴氏杆菌。
[0023]进一步的，自杀质粒介导同源重组法构建缺失arcA基因、gatA基因的自杀质粒时，需要设计引物分别扩增arcA基因、gatA基因的上游和下游同源臂，以及扩增同源臂之间的卡那霉素抗性基因、红霉素抗性基因片段；涉及到的引物如SEQ ID NO：14
‑
SEQ ID NO：35所示。
[0024]本专利技术还提供一种上述缺失arcA基因的多杀性巴氏杆菌或上述缺失arcA基因、gatA基因的多杀性巴氏杆菌。
[0025]本专利技术还提供一种上述缺失arcA基因的多杀性巴氏杆菌或上述缺失arcA基因、gatA基因的多杀性巴氏杆菌作为禽类减本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.多杀性巴氏杆菌的arcA基因，其特征在于，所述多杀性巴氏杆菌的arcA基因的基因编号为A0R64_00400，所述A0R64_00400的序列如SEQ ID NO：1所示。2.权利要求1所述的arcA基因用于多杀性巴氏杆菌减毒的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用的方法包括：通过自杀质粒介导同源重组法构建缺失arcA基因的多杀性巴氏杆菌。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用的方法具体包括：S1、构建缺失arcA基因的自杀质粒；S2、将步骤S1构建好的自杀质粒转入感受态大肠杆菌后与多杀性巴氏杆菌进行接合转移，筛选阳性菌落；S3、通过PCR筛选得到缺失arcA基因的多杀性巴氏杆菌。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤S1中，构建缺失arcA基因的自杀质粒方法包括：1)根据多杀性巴氏杆菌和质粒的序列信息，设计引物分别扩增arcA基因的上游和下游同源臂，以...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵新新，程安春，梁圣，杨福香，唐楠，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：