用于从多能干细胞产生心肌细胞的培养基和方法技术

本发明专利技术提供用于从多能干细胞产生心肌细胞的培养基和方法。所述培养基无血清和无动物源成分，包含基础培养基以及烟酰胺类化合物、人血小板裂解物(PLT)、肝素类化合物、胰岛素、人转铁蛋白和人血清白蛋白(HSA)。应用该培养基和方法，可以高效地提供高纯度和高数量的心肌细胞。肌细胞。

【技术实现步骤摘要】
用于从多能干细胞产生心肌细胞的培养基和方法


[0001]本专利技术涉及干细胞生物学领域，具体涉及用于从多能干细胞(也称作多潜能干细胞，PSC)产生心肌细胞(CM)的培养基、试剂盒和方法及其心肌细胞群。

技术介绍

[0002]冠心病(Coronary Artery Disease，CAD)是仅次于高血压的第二大心血管疾病，在全球范围内的发病率和死亡率非常高，近几年其发病率在中国也呈上升趋势。目前冠心病的主要临床治疗方法如药物治疗、经皮冠状动脉介入术(PCI)及冠状动脉搭桥术(CABG)，都不能显著恢复受损后的心脏功能。由于人心肌没有再生能力，一旦由于心梗等原因受损死亡后，一旦超过临界点，心脏会进入恶性代偿的循环，最终不可逆的发展进入心衰。根据中国的流行病学调查，人群中的慢性心衰患病率为0.9％，至少有1000万病人，总死亡率达32％。
[0003]诱导多能干细胞(iPSC)具备胚胎干细胞(ESC细胞)的所有分化能力，并且因其易扩增，可定向分化为心肌细胞，且无免疫排斥反应和伦理学问题，因此提供了治疗冠心病的新思路。最近的研究发现，移植人ESC/iPSC产生的心肌细胞后，心梗猪的心功能得到了显著程度的改善，形态学和生理学结果都显示移植的心肌整合进入宿主心脏并形成有效的收缩功能单元(Kawamura et al.，2012；Shiba et al.,2012)。
[0004]虽然从多能干细胞体外分化为心肌细胞的过程在原理层面已经较为明确，且目前已有多种诱导分化方案，但现有的分化方案仍存在培养时间长、效率低、细胞分离难度大，获得的心肌细胞在数量和质量上无法达到临床使用要求等问题。
[0005]因此，本领域中仍然需要更为稳健和高效的由多能干细胞诱导产生心肌细胞的新方案。

技术实现思路

[0006]经过深入的研究，本专利技术人开发了一种无血清和无动物源成分的心肌细胞培养基，该心肌细胞培养基可以作为心肌细胞维持培养基的基础培养基在从多能干细胞产生心肌细胞的分化阶段提升心肌细胞的分化效率(例如增加心肌细胞比例和数量)。此外，本专利技术人进一步发现，该心肌细胞培养基还可以作为心肌细胞成熟培养基促进心肌细胞的进一步成熟。在此基础上，本专利技术还提出了一种用于从多能干细胞(PSC)产生诱导心肌细胞(iCM)的方法。应用本专利技术的培养基和方法可以高效地提供高纯度和高数量的心肌细胞。
[0007]因此，在第一方面，本专利技术提供了一种无血清和无动物源成分的心肌细胞培养基，其包含基础培养基以及烟酰胺类化合物、人血小板裂解物(PLT)、肝素类化合物、胰岛素、人转铁蛋白和人血清白蛋白(HSA)。
[0008]在一个或多个实施方案中，所述烟酰胺类化合物为烟酰胺、其衍生物或类似物、或它们的盐。最优选，所述烟酰胺类化合物为烟酰胺。
[0009]在一个或多个实施方案中，肝素类化合物为肝素、其衍生物或类似物、或它们的
盐。最优选地，所述肝素类化合物为肝素或肝素钠。
[0010]在一个或多个实施方案中，按心肌细胞培养基总量计，所述烟酰胺类化合物的浓度为0.5
‑
20mM，优选地1
‑
10mM，例如，1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM。
[0011]在一个或多个实施方案中，按心肌细胞培养基总量计，所述肝素类化合物的浓度为0.1
‑
100μg/mL，优选地0.1
‑
50μg/mL，例如，0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、3μg/mL、5μg/mL、7μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、12μg/mL、14μg/mL、15μg/mL、16μg/mL、18μg/mL、19μg/mL、20μg/mL、22μg/mL、24μg/mL、26μg/mL、28μg/mL、30μg/mL、32μg/mL、34μg/mL、36μg/mL、38μg/mL、40μg/mL、42μg/mL、44μg/mL、46μg/mL、48μg/mL、或50μg/mL。
[0012]在一个或多个实施方案中，按心肌细胞培养基总量计，所述PLT的浓度为0.1
‑
10体积％，优选地0.1
‑
5体积％，例如，0.1体积％、0.5体积％、1体积％、1.5体积％、2体积％、2.5体积％、3体积％、3.5体积％、4体积％、4.5体积％、或5体积％。
[0013]在一个或多个实施方案中，按心肌细胞培养基总量计，所述胰岛素的浓度为0.1
‑
20μg/mL，优选地1
‑
15μg/mL，例如，1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、11μg/mL、12μg/mL、13μg/mL、14μg/mL、或15μg/mL。
[0014]在一个或多个实施方案中，按心肌细胞培养基总量计，所述人转铁蛋白的浓度为1
‑
100μg/mL，优选地1
‑
20μg/mL，例如，1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、50μg/mL、55μg/mL、60μg/mL、65μg/mL、70μg/mL、75μg/mL、80μg/mL、85μg/mL、90μg/mL、95μg/mL、或100μg/mL。
[0015]在一个或多个实施方案中，按心肌细胞培养基总量计，所述HSA的浓度为0.2
‑
20mg/mL，优选地1
‑
10mg/mL，例如，1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、或10mg/mL。
[0016]在一个或多个实施方案中，所述心肌细胞培养基还包含选自以下的一种或多种或全部成分：硫代甘油(MTG)；丙酮酸盐；乙醇胺；抗坏血酸、其衍生物或它们的盐；亚硒酸盐；和谷氨酰胺或其衍生物。
[0017]在一个优选实施方案中，所述心肌细胞培养基包含：
[0018](i)0.1
‑
20mg/mL HSA；
[0019](ii)10
‑
200μM MTG；
[0020](iii)50
‑
100μg/mL抗坏血酸；
[0021](iv)1
‑
10mM烟酰胺；
[0022](v)50
‑
200μg/mL丙酮酸盐；
[0023](vi)1
‑
15μg/mL胰岛素；
[0024](vii)1
‑
20μg/mL人转铁蛋白；
[0025](viii)5
‑
40ng/mL亚硒酸盐；
[0026](ix)5
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种无血清和无动物源成分的心肌细胞培养基，其包含基础培养基以及烟酰胺类化合物、人血小板裂解物(PLT)、肝素类化合物、胰岛素、人转铁蛋白和人血清白蛋白(HSA)。2.权利要求1的心肌细胞培养基，其中，所述烟酰胺类化合物为烟酰胺、其衍生物或类似物、或它们的盐。3.权利要求1的心肌细胞培养基，其中，肝素类化合物为肝素、其衍生物或类似物、或它们的盐。4.权利要求1
‑
3任一项的心肌细胞培养基，其中，按心肌细胞培养基总量计，所述烟酰胺类化合物的浓度为0.5
‑
20mM，优选地1
‑
10mM。5.权利要求1
‑
3任一项的心肌细胞培养基，其中，按心肌细胞培养基总量计，所述肝素类化合物的浓度为0.1
‑
100μg/mL，优选地0.1
‑
50μg/mL。6.权利要求1
‑
3任一项的心肌细胞培养基，其中，按心肌细胞培养基总量计，所述PLT的浓度为0.1
‑
10体积％，优选地0.1
‑
5体积％。7.权利要求1
‑
3任一项的心肌细胞培养基，其中，按心肌细胞培养基总量计，所述胰岛素的浓度为0.1
‑
20μg/mL，优选地1
‑
15μg/mL。8.权利要求1
‑
3任一项的心肌细胞培养基，其中，按心肌细胞培养基总量计，所述人转铁蛋白的浓度为1
‑
100μg/mL，优选地1
‑
20μg/mL。9.权利要求1
‑
3任一项的心肌细胞培养基，其中，按心肌细胞培养基总量计，所述HSA的浓度为0.2
‑
20mg/mL，优选地1
‑
10mg/mL。10.权利要求1
‑
3任一项的心肌细胞培养基，其中，所述心肌细胞培养基还包含选自以下的一种或多种或全部成分：硫代甘油(MTG)；丙酮酸盐；乙醇胺；抗坏血酸、其衍生物或它们的盐；亚硒酸盐；和谷氨酰胺或其衍生物。11.权利要求10的心肌细胞培养基，其中，所述心肌细胞培养基包含：(i)1
‑
10mg/mL HSA；(ii)10
‑
200μM MTG；(iii)50
‑
100μg/mL抗坏血酸；(iv)1
‑
10mM烟酰胺；(v)50
‑
200μg/mL丙酮酸盐；(vi)1
‑
15μg/mL胰岛素；(vii)1
‑
20μg/mL人转铁蛋白；(viii)5
‑
40ng/mL亚硒酸盐；(ix)5
‑
50μM乙醇胺；(x)0.1
‑
5体积％PLT；(xi)0.1
‑
50μg/mL肝素钠；和(xii)1.0
‑
5.0体积％Glutamax。12.权利要求1
‑
3任一项的心肌细胞培养基，其中，所述基础培养基选自：DMEM，DMEM/F12、Ham's F12、RPMI
‑
1640、IMDM、BME、IMDM/F12、
ɑ
‑
MEM或其组合。13.一种心肌细胞维持培养基，其包含权利要求1
‑
12任一项的心肌细胞培养基作为基础培养基并包含WNT信号通路激活剂作为补充剂。14.权利要求13的心肌细胞维持培养基，其中，所述WNT信号通路激活剂为选自<...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞君英，吴文青，张颖，
申请(专利权)人：安徽中盛溯源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：