杂交鹅掌楸LhMIR394B基因在增强体胚发生效率中的应用制造技术

本发明专利技术公开了杂交鹅掌楸LhMIR394B基因在增强体胚发生效率中的应用，属于植物分子生物学领域。本发明专利技术的杂交鹅掌楸LhMIR394B基因在增强体胚发生效率中的应用，所述杂交鹅掌楸LhMIR394B基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术以杂交鹅掌楸叶片为材料，通过克隆得到杂交鹅掌楸LhMIR394B基因，在此基础上构建其过量表达载体pBI121

【技术实现步骤摘要】
杂交鹅掌楸LhMIR394B基因在增强体胚发生效率中的应用


[0001]本专利技术属于植物分子生物学领域，更具体地说，涉及杂交鹅掌楸LhMIR394B基因在增强体胚发生效率中的应用。

技术介绍

[0002]鹅掌楸属(Liriodendron)是木兰科(Magnoliaceae)下的一属，曾有数十种广泛分布于北半球，在第四纪冰川后大部分已灭绝，现仅存2个自然种，即鹅掌楸(L.chinense)和北美鹅掌楸(L.tulipifera)。杂交鹅掌楸(L.chinense
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L.tulipifera)是我国著名林木育种学家叶培忠教授在1963年，选用中国庐山种源鹅掌楸为母本，与北美鹅掌楸杂交后选育而成，且表现出明显的杂种优势。杂交鹅掌楸树形美观，叶形奇特，花大美丽，生长快，材质好，是重要的庭院绿化、造林以及用材树种。然而杂交鹅掌楸自身繁殖能力差、结实率低，且通过种子繁殖的实生苗遗传变异大。而体细胞胚胎发生途径具有繁殖快、遗传稳定等优势，杂交鹅掌楸已经具有成熟的体胚发生体系，但其体胚发生过程中的分子调控机制还有待深入研究。
[0003]miRNA普遍存在于植物基因组中，是一类由内源基因编码的长度约为21个核苷酸的非编码单链RNA分子，主要在转录后水平通过与靶mRNA的结合来调节基因的表达，从而在植物的器官形态建成、生长发育及对外界胁迫的响应等方面发挥重要作用。其中，miR394不仅影响着植物的抗逆水平，而且在植物的生长发育方面扮演着重要角色。尤其是在植物茎尖干细胞调控方面，miR394及其靶基因能够抑制茎尖干细胞标记基因WUSCHEL和CLV3的负反馈调节，从而维持植物茎尖分生组织的正常发育。但是miR394在体胚发生中的功能少有研究。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供杂交鹅掌楸LhMIR394B基因在增强体胚发生效率中的应用
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0006]杂交鹅掌楸LhMIR394B基因在增强体胚发生效率中的应用，所述杂交鹅掌楸LhMIR394B基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]进一步地，所述的应用包括以下步骤：
[0008](1)构建LhMIR394B基因的载体；
[0009](2)将所构建的LhMIR394B基因的载体转化到植物或植物组织中；
[0010](3)培育筛选得到体胚发生效率增强的植物或植物组织。
[0011]进一步地，所述的植物为杂交鹅掌楸。
[0012]进一步地，所述的植物组织为杂交鹅掌楸胚性愈伤组织。
[0013]进一步地，所述的转化是农杆菌侵染法。
[0014]进一步地，所述的载体是植物表达载体。
[0015]进一步地，所述的植物表达载体是pBI121
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LhMIR394B。
[0016]相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0017](1)本专利技术以杂交鹅掌楸叶片为材料，通过克隆得到杂交鹅掌楸LhMIR394B基因。同时，在此基础上构建其过量表达载体pBI121
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LhMIR394B，转入杂交鹅掌楸胚性愈伤组织中，LhMIR394B基因在杂交鹅掌楸胚性愈伤组织中高效表达。
[0018](2)p35S：LhMIR394B、未转化的野生型166302愈伤组织(WT)通过液体悬浮系诱导体胚发生两个月后，过表达LhMIR394B的转基因愈伤相较于野生型，体胚发生数目显著提高。
附图说明
[0019]图1是基因目的片段的克隆PCR结果图；
[0020]图2是pBI121
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LhMIR394B大肠杆菌单菌落菌液PCR电泳图；
[0021]图3是pBI121
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LhMIR394B农杆菌单菌落菌液PCR电泳图；
[0022]图4是过表达LhMIR394B转基因愈伤PCR验证结果图；
[0023]图5是过表达LhMIR394B转基因与野生型愈伤组织进行体胚诱导情况图；
[0024]图6是过表达LhMIR394B转基因与野生型愈伤组织的体胚发生数目统计分析图。
具体实施方式
[0025]下面结合具体实施例对本专利技术进一步进行描述。以下实施例中，未详细叙述的操作均为常规生物学实验操作，可参照分子生物学实验手册以及现有公开的期刊文献等进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026]实施例1：杂交鹅掌楸LhMIR394B基因的克隆
[0027]1、基因组DNA的提取
[0028]取指头大小新鲜的杂交鹅掌楸植株的叶片，充分研磨；待叶片成粉末状后，在离心管中加入700μL CTAB裂解液，搅拌均匀后将其置于65℃水浴或空气浴，裂解30min，注意每5min震荡混匀一次；向离心管中加入等体积的氯仿和异戊醇(体积比为24∶1)，涡旋混匀后，12000rpm离心5min；取上清液再加入等体积的氯仿和异戊醇(体积比为24：1)，重复上一步；取上清液于另一干净的1.5mL离心管中，加入1.5倍体积冰乙醇，4℃放置30min，使DNA沉淀在离心管下部；沉淀后，12000rpm离心5min，去除上清液，加入700μL 70％或75％的酒精清洗，轻轻上下颠倒摇匀后，12000rpm离心2min，去除上清液，置于通风处中吹干，加入50μL65℃预热的ddH2O，放入65℃温水浴5min，使DNA溶解在水中，待DNA溶解后使用Nanodrop检测提取浓度和纯度。
[0029]2、目的基因的克隆
[0030]1)引物的设计：根据已有的杂交鹅掌楸基因组数据，运用BLAST进行搜索比对，按照比对结果利用Primer 5.0设计相应引物，并用Oligo7.0对引物进行分析，最后确定引物如下：
[0031]LhMIR394B
‑
F：5
’‑
CCTATAAATACACCTCCCTACCTC
‑3’
，
[0032]LhMIR394B
‑
R：5
’‑
AGCGAAATTTACAGAACTTGCTT
‑3’
。
[0033]2)PCR扩增反应
[0034]以基因组DNA为模板，使用Vazyme公司Phanta Max Super
‑
Fidelity DNA Polymerase进行PCR反应，扩增体系为25μL 2
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Phanta Max Buffer、1μL dNTP Mix(10mM each)、2μL LhMIR394B
‑
F、2μL LhMIR394B
‑
R、1μL Phanta Max Super
‑
Fidelity DNA Polymerase、1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.杂交鹅掌楸LhMIR394B基因在增强体胚发生效率中的应用，所述杂交鹅掌楸LhMIR394B基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建LhMIR394B基因的载体；(2)将所构建的LhMIR394B基因的载体转化到植物或植物组织中；(3)培育筛选得到体胚发生效率增强的植物或植物组织。3.根据权利要求2所述的应用，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：施季森，何石婵，鲁路，陈金慧，陆叶，成铁龙，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：