一种过表达人IL-1Ra的间充质干细胞及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种过表达IL

【技术实现步骤摘要】
一种过表达人IL
‑
1Ra的间充质干细胞及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学与生物医药领域，具体涉及过表达人IL
‑
1Ra的间充质干细胞及其在预防和治疗GVHD中的应用。

技术介绍

[0002]急性移植物抗宿主病（acute graft versus host disease, aGVHD）是异基因造血干细胞移植（allogeneic
‑ꢀ
hematopoietic stem cell transplantation, allo
‑
HSCT）后常见的并发症，也是造成移植后患者死亡的主要原因之一。国内资料显示，中度和重度aGVHD发生率为13%
‑
47%，发生率的差异主要与危险因素不同有关。
[0003]针对aGVHD，目前标准的皮质类固醇激素治疗的总体有效率为50%，各种免疫抑制剂治疗的完全缓解率约为30%。尽管糖皮质激素及免疫抑制剂能部分控制aGVHD的进展，但治疗期间仍可产生严重的激素耐药、继发感染以及伴随着移植物抗肿瘤效应（GVL）的减弱等，最终导致患者治疗不耐受或者肿瘤的复发。
[0004]Ferrara等将aGVHD的发病机制归纳为三个阶段：
①
抗原提呈细胞（antigen presenting cells，APCs）的活化；
②
供者T细胞的活化、增殖、分化与迁移；
③
活化的供者Ｔ细胞及其他免疫细胞释放各种炎症性细胞因子（包括IL
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1、TNF
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α、IFN
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γ等），并对靶器官造成损伤，引起皮肤、肝脏及肠道等组织器官特有的临床表现，即靶组织的损伤。
[0005]白细胞介素
‑
1（IL
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1）是一种促炎细胞因子，通过IL
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1受体信号传导驱动炎症反应。有研究表明，在GVHD患者的血液和唾液中检测到高水平的白细胞介素
‑
1β（IL
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1β），这可能加剧GVHD的发展。IL
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1受体拮抗剂（IL
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1Ra）通过与IL
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1R1竞争性结合来阻断IL
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1的活性。它在炎症过程中起负反馈调节作用。
[0006]间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是不同于造血干细胞的另一类多能干细胞。有研究表明，在GVHD患者的血液和唾液中检测到高水平的白细胞介素
‑
1β (IL
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1β)，这可能加剧GVHD的发展。在炎症过程中，IL
‑
1受体拮抗剂（IL
‑
1Ra）通过与IL
‑
1R1竞争性结合来阻断IL
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1的活性，从而对炎症产生负反馈调节作用。

技术实现思路

[0007]为了提高MSCs在治疗GVHD中效果不稳定等问题，本专利技术提供一种过表达IL
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1Ra的间充质干细胞，分泌IL
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1Ra量大、不需要多代扩增，能够在较短时间内完成MSCs回输，提高MSCs治疗效果。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。
[0009]一种过表达IL
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1Ra的间充质干细胞在制备预防和治疗GVHD中的应用。
[0010]所述MSCs可以是人的骨髓、脐带或脂肪来源的，优选为脐带来源的。
[0011]所述过表达IL
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1Ra的间充质干细胞可以通过常规的分子生物学方法获得，如，用含IL
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1Ra目的质粒包装制备慢病毒，然后感染MSCs，筛选后获得稳转细胞系。
[0012]所述过表达IL
‑
1Ra的编码基因是人源的，其翻译的氨基酸序列在GenBank中的登
录号可以是NP_776214.1，NP_776213.1，NP_000568.1，NP_776215.1，NP_001305843.1或NP_001366289.1；优选的，所述过表达IL
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1Ra的编码基因转录的mRNA在GenBank中的登录号为NM_000577.5。
[0013]本专利技术具有以下优点：本专利技术提供的过表达IL
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1Ra的MSCs可用于预防GVHD的发生。本专利技术提出的MSC
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oeIL
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1Ra的制备方法简单，可稳定高表达人IL
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1Ra，兼具MSCs的抗炎及损伤修复作用，在间充质干细胞预防和治疗GVHD领域具有广阔的应用前景。
附图说明
[0014]图1为两组MSC细胞系的mRNA（a）、Western blot（b）及ELISA（c）结果；图2为不同处理小鼠体重变化；图3为不同处理小鼠GVHD评分变化；图4为不同处理小鼠生存曲线。
实施方式
[0015]下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。
[0016]实施例1 过表达IL
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1Ra的MSCs的构建1. 过表达IL
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1Ra的MSCs稳转细胞系的构建1.1 人脐带MSCs的分离、培养及扩增收集新生儿脐带组织（产妇已签署知情同意书），加入少量DMEM/F12完全培养基（10%FBS，0.272g/L L
‑
谷氨酰胺，10ng/mL bFGF，100U/mL青霉素，100mg/mL链霉素），无菌操作台内用无菌剪刀将组织尽可能剪碎，用0.125%的胰酶和1%的胶原酶II分别消化半小时，收集液体至15mL离心管内，1500rpm离心10min，弃掉上清将细胞沉淀加入上述的DMEM/F12完全培养液重悬，转移至细胞培养瓶中，置入孵箱内，在饱和湿度、37℃、5% CO2条件下孵育，第3天吸掉上清，清除未贴壁细胞及组织碎片，添加新鲜培养基，以后隔天更换新鲜培养基。细胞密度为80%时，吸掉上清，用PBS清洗一遍细胞，加入0.25%胰酶消化，待细胞变圆漂浮后加入完全培养基终止反应，收集液体离心后将1瓶细胞传代成3瓶细胞，加入新鲜培养基继续培养，第四代细胞用于实验。
[0017]1.2 MSCs的基因修饰及稳转细胞系的建立以GenBank中NM_000577.5序列的DNA序列为目的基因连接到GV367载体（Ubi
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MCS
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SV40
‑
EGFP
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IRES
‑
puromycin），构建oeIL
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1Ra
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GV367重组表达载体；同样的方法将无关序列（5
’‑
TTCTCCGAACGTGTCACGT
‑3’
）连接到GV367载体，构建Mock
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GV367重组表本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种过表达IL
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1Ra的间充质干细胞在制备预防和治疗GVHD中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞为人的骨髓、脐带或脂肪来源的。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞为人的脐带来源的。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述过表达IL
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1Ra的编码基因是翻译的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑成云，姜杨，王顺业，孔德晓，
申请(专利权)人：山东大学第二医院，
类型：发明
国别省市：