一种特异性感染L6细胞的腺相关病毒突变体制造技术

本发明专利技术涉及病毒载体的包装及筛选，尤其涉及AAV突变体的包装及筛选，具体为一种特异性感染L6细胞的腺相关病毒突变体；本发明专利技术通过构建AAV9的肽段突变文库,经过筛选验证获得插入了7个氨基酸的新的AAV9突变体,突变体可以有效的在MOI＝1E+5情况下有效感染L6细胞，达到比天然AAV9血清型MOI＝1E+5更高的感染效果，经过筛选获得的AAV9

【技术实现步骤摘要】
一种特异性感染L6细胞的腺相关病毒突变体


[0001]本专利技术涉及病毒载体的包装及筛选，尤其涉及AAV突变体的包装及筛选，具体为一种特异性感染L6细胞的腺相关病毒突变体。

技术介绍

[0002]腺相关病毒(adeno
‑
associatedvirus,AAV)是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒。由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，已经逐渐成为体内基因治疗递送的重要平台。作为递送基因治疗的有力工具，AAV的开发和改造也成为了业界关注的焦点之一。对AAV血清型进行改造修饰，能够增强AAV病毒转导效率并且还能阻止对AAV衣壳的免疫反应；目前对AAV衣壳蛋白改造，主要有定向改造、合理设计和计算机辅助设计等技术。
[0003]L6细胞是一种大鼠的成肌细胞，是Yaffe在甲基胆蒽存在的情况下从大鼠大腿肌原代培养的最初两代细胞中分离得到的细胞系，在培养基中融合形成多核的肌管和横纹肌纤维，成肌细胞(myoblast)是在成骨骼肌组织中发现的在创伤后重建肌肉组织的前体细胞。但目前现存的AAV病毒感染该细胞系的效率偏低这样在进行体外测试时，会限制AAV病毒的使用，导致体外检测用的AAV用量较大。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中的缺陷，本专利技术通过设计和改造在AAV9的Cap序列588位氨基酸后随机插入7个氨基酸片段，构建获得AAV9不同肽段突变体文库，在L6细胞中进行筛选以获得具有高效感染成肌细胞的新的AAV血清型，以便满足L6细胞系作为体外研究应用,同时扩大了临床上使用AAV治疗肌肉疾病的选择。
[0005]本专利技术的目的通过以下方案实现：
[0006]本专利技术公开了一种插入异源肽的AAV9血清型衣壳蛋白突变体；
[0007]所述异源肽为：氨基酸序列为ANLKKDV(SEQ ID NO:12)所组成的多肽；
[0008]所述AAV9血清型衣壳蛋白氨基酸588～589之间被所述的异源肽插入。
[0009]本专利技术公开了编码上述AAV9血清型衣壳蛋白突变体的核酸分子。
[0010]本专利技术公开了可操作地连接上述核酸分子的核酸载体。
[0011]本专利技术公开了含有上述核酸载体的宿主细胞。
[0012]本专利技术公开了一种组合物或试剂盒，含有上述AAV9血清型衣壳蛋白突变体、核酸分子或核酸载体。
[0013]本专利技术公开了上述AAV9血清型衣壳蛋白突变体、核酸分子或核酸载体在用于感染L6细胞的用途，所述用途属于非诊断和治疗目的的。
[0014]与现有技术相比，本专利技术有如下有益效果：
[0015]本技术方案通过构建AAV9的肽段突变文库,经过筛选验证获得插入了7个氨基酸
的新的AAV9突变体,突变体可以有效的在MOI＝1E+5情况下有效感染L6细胞，达到比天然AAV9血清型MOI＝1E+5更高的感染效果，经过筛选获得的AAV9
‑
L601的效果最好，在同样的MOI条件下，感染阳性率相对于对照AAV9血清型明显提升，通过luciferase(RLU)值检测统计其倍数为10.8倍，有效降低AAV感染细胞的使用量，节省实验成本。
附图说明
[0016]图1为实施例1中pAAV
‑
shortUBC
‑
mScarlet
‑
polyA
‑
P40
‑
AAV9
‑
Cap
‑
FLEX
‑
SV40 polyA表达框图；
[0017]图2为实施例1中pAAV
‑
shortUBC
‑
mScarlet
‑
polyA
‑
P40
‑
AAV9
‑
Cap
‑
FLEX
‑
SV40 polyA载体图谱；
[0018]图3为AAV9文库构建及筛选流程图；
[0019]图4为实施例2中不同血清型感染L6细胞荧光图；
[0020]图5为实施例2中不同血清型感染L6细胞萤火虫荧光素值(RLU)图。
具体实施方式
[0021]下面通过实施例的方式进一步说明本专利技术，但并不因此将本专利技术限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0022]实施例1、AAV97
‑
mer随机肽段插入文库构建：
[0023]文库由以下载体构成:
[0024]文库穿梭载体:pAAV
‑
shortUBC
‑
mScarlet
‑
polyA
‑
P40
‑
AAV9
‑
Cap
‑
FLEX
‑
SV40 polyA，如图1所示。
[0025]实施例2、AAV9文库构建及筛选流程：
[0026]通过构建AAV9的肽段随机突变文库，筛选到插入了7个氨基酸的新的AAV9突变体，如图3所示。
[0027]1、突变体文库制备
[0028]1.1化学合成AAV9
‑
7mer
‑
NNS以下两个片段：
[0029]5'CCACCAGAGTGCCCAANNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSGCACAGGCGCAG 3'(S EQ ID NO:1)；
[0030]5'CGGTCTGCGCCTGTGCSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNTTGGGCACTCTG 3'(SE Q ID NO:2)；
[0031]其中NNS代表随机编码序列。
[0032]1.2将合成的AAV9
‑
7mer
‑
NNS正链与反链引物各加10μL(引物的终浓度为10mM)采用退火的方式来获得AAV9
‑
7mer
‑
NNS模板。退火程序为：95℃，5min；95℃，1min；92min，1min；4℃，60min。其中，第二步和第三步，每个循环降3℃，一共25个循环。
[0033]1.3将质粒pAAV
‑
short UBC
‑
mScarlet
‑
polyA
‑
P40
‑
AAV9
‑
Cap
‑
FLEX
‑
SV40 polyA(其结构和插入位点如图2所示)用BsmBI进行单酶切，酶切体系(50uL)如表1所示。
[0034]表1
[0035][0036][0037]55℃酶切4h后进行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下用刀片将大本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种插入异源肽的AAV9血清型衣壳蛋白突变体，其特征在于，所述异源肽为：氨基酸序列为ANLKKDV所组成的多肽；所述AAV9血清型衣壳蛋白氨基酸588～589之间被所述的异源肽插入。2.核酸分子，其特征在于，编码权利要求1所述的AAV9血清型衣壳蛋白突变体。3.核酸载体，其可操作地连接有权利要求2所述的核酸分子。4.宿主细胞，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨佳丽，杨兴林，潘讴东，张利平，李琴，
申请(专利权)人：和元生物技术上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：