人乳头瘤病毒HPV35L1蛋白的表达和类病毒样颗粒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及医药生物领域，具体涉及人乳头瘤病毒L1蛋白的表达和类病毒样颗粒及其制备方法。对HPV35型L1蛋白的氨基酸序列进行截短，并针对该截短后的蛋白的编码核苷酸序列进行密码子优化得到优化的编码核苷酸序列，最后配合含有特定SD序列无标签表达载体实现无标签表达纯化。本发明专利技术通过上述改进使得在原核表达系统例如大肠杆菌表达系统中可以获得更高的蛋白表达量，且得到质量更均一的VLP。且得到质量更均一的VLP。

【技术实现步骤摘要】
人乳头瘤病毒HPV35 L1蛋白的表达和类病毒样颗粒及其制备方法


[0001]本专利技术涉及医药生物领域，具体涉及人乳头瘤病毒L1蛋白的表达和类病毒样颗粒及其制备方法。更具体涉及人乳头瘤病毒HPV35 L1蛋白VLP（类病毒样颗粒）的构建及表达。

技术介绍

[0002]人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）是一种无包膜的闭环双链DNA病毒，属乳多空病毒科多瘤病毒亚科，主要侵犯人体的上皮黏膜组织，进而诱发各种良性及恶性增生病变。目前已鉴定出来的不同亚型HPV超过200种，HPV感染具有明显的组织特异性，不同型别的HPV对于皮肤和黏膜的嗜向性不同，能诱发不同的乳头状病变，大约有30多种HPV型别与生殖道感染有关，其中有20多种与肿瘤相关。
[0003]根据HPV诱发病变的良恶性不同，HPV可大致分为两类：1）高危型（如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV35等）：高危型HPV与人类多种组织恶性肿瘤密切相关，主要引起重度不典型增生和浸润癌；2）低危型（如HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV54、HPV72、HPV81等）：低危型HPV可引起表皮细胞良性增殖性性病，如尖锐湿疣和扁平湿疣等。HPV主要由病毒外壳和基因组DNA构成。基因组长约7900bp，有8个病毒蛋白编码基因。其中6个ORF编码的蛋白在病毒复制的早期表达，称为早期蛋白；2个ORF编码的蛋白在病毒复制的晚期表达，称为晚期蛋白。晚期蛋白包括主要外壳蛋白L1及次要外壳蛋白L2，并参与病毒外壳的形成。HPV病毒外壳蛋白能够进行自组装，目前在专利文献中，多采用酵母表达系统或者昆虫表达系统或者在哺乳动物细胞表达系统里面单独表达的L1蛋白或将L1 蛋白与L2蛋白共表达时均能自组装成病毒样颗粒（virus
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like particle ,VLP），利用外源表达体系生产的VLP免疫后能够在体内诱发产生中和抗体，获得良好的免疫保护效果。但是利用真核表达系统在体内直接表达组装VLP，产生VLP的性质并不是很均一，并且真核表达系统的成本很高，不利于产业化。
[0004]目前针对HPV35型在CN202110442669.6中报道，其中用的是汉逊酵母表达系统产生HPV35L1蛋白，汉逊酵母表达系统是真核表达系统，在体内直接组装成VLP，该专利中并没有提出是否在大肠杆菌原核表达系统里是否可以正常表达合格标准的蛋白，因为大肠杆菌原核表达系统并不具备汉逊酵母表达系统翻译后修饰等功能，所以在原核表达系统里表达HPV35 L1是有一定难度的。因此，需要研究解决在原核表达系统里面表达HPV35L1蛋白困难的问题，来获得更均一的VLP以及在产业应用上有更低的成本。

技术实现思路

[0005]本专利技术人针对基于疫苗成品成本的考虑，在原核表达系统里面表达HPV35 L1 蛋白，并解决了在原核表达系统里面表达HPV35L1蛋白困难的问题。具体通过以下改进实现：对HPV35型L1蛋白的氨基酸序列进行截短，并针对该截短后的蛋白的编码核苷酸序列进行密码子优化得到优化的编码核苷酸序列，最后配合含有特定SD序列的无标签表达载体实现
高效表达和纯化。
[0006]首先，本专利技术将HPV35L1蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO：3所示）做N/C端截短处理，为了获得更好的蛋白表达率。N端截短不多于10个氨基酸，优选4个氨基酸。C端截短不多于30个氨基酸，优选28个氨基酸，具体的截短后的氨基酸见SEQ ID NO：1。通过N/C端截短处理后，在无标签表达载体上表达并且获得更高质量的蛋白及VLP。
[0007]其中SEQ ID NO：1所示氨基酸序列如下：1
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MSNEATVYLP PVSVSKVVST DEYVTRTNIY YHAGSSRLLA VGHPYYAIKK51
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QDSNKIAVPK VSGLQYRVFR VKLPDPNKFG FPDTSFYDPA SQRLVWACTG101
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VEVGRGQPLG VGISGHPLLN KLDDTENSNK YVGNSGTDNR ECISMDYKQT151
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QLCLIGCRPP IGEHWGKGTP CNANQVKAGE CPPLELLNTV LQDGDMVDTG201
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FGAMDFTTLQ ANKSDVPLDI CSSICKYPDY LKMVSEPYGD MLFFYLRREQ251
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MFVRHLFNRA GTVGETVPAD LYIKGTTGTL PSTSYFPTPS GSMVTSDAQI301
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FNKPYWLQRA QGHNNGICWS NQLFVTVVDT TRSTNMSVCS AVSTSDSTYK351
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NDNFKEYLRH GEEYDLQFIF QLCKITLTAD VMTYIHSMNP SILEDWNFGL401
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TPPPSGTLED TYRYVTSQAV TCQKPSAPKP KDDPLKNYTF WEVDLKEKFS451
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ADLDQFPLGR KFLLQAGLKA。
[0008]其次，为了利用大肠杆菌系统高效的表达HPV35L1蛋白，专利技术人根据SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，针对大肠杆菌系统进行核苷酸序列的密码子优化。优化原则包括：a）按照大肠杆菌遗传密码使用频率表选用使用频率最高或较高的密码子；b）消除常用的限制性内切酶识别位点。通过上述原则经过优化的核苷酸序列并进行多次筛选，获得了优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，进一步提供含有所述编码核酸的表达盒，表达载体和重组宿主细胞。优选地，其是大肠杆菌。
[0009]最后，本专利技术提供特定SD序列的无标签表达载体。对于表达载体而言，表达融合蛋白的载体pGEX的特点是在载体上接上了一种26kDa的谷胱甘肽S
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转移酶基因（GST），与其它的融合载体相比，它具有纯化条件温和、步骤简单、无变性剂加入，以及纯化后蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性的特点；具有较好的应用价值,但载体pGEX编码的GST融合蛋白标签可能会增加药用蛋白产品的安全性隐患。对此，本专利技术将该载体的GST标签去除，并且替换能够高效表达HPV35型L1蛋白的SD序列，而形成新的适合HPV35 L1蛋白的表达载体。其中，优选地采用的SD序列为AGGAGATATA（5'to3'）。
[0010]本专利技术还提供一种制备HPV35型L1 VLP的方法，其特征在于，包括如下步骤：根据所述的方法得到的HPV35型L1蛋白的步骤，调节其所在缓冲液的pH和盐浓度，使其自组装形成VLP。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种截短的HPV35型L1蛋白，其是在野生型HPV35型L1蛋白的基础上，在其N端截短不多于10个氨基酸，优选4个氨基酸，且在其C端截短不多于30个氨基酸，优选28个氨基酸；优选地，截短的HPV35型L1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.编码如权利要求1所述的截短的HPV35型L1蛋白的核酸；优选地，其经过密码子优化的核酸；更优选地，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.含有SD序列和编码如权利要求2所述的核酸，优选地，所述SD序列的核苷酸序列为5`
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AGGAGGAATTA
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3`。4.含有如权利要求2或3所述的编码核酸的表达盒或表达载体。5.如权利要求4所述的表达盒或表达载体，其特征在于，其是原核表达载体，更优选地是在载体pGEX基础上去除了GST标签序列，并且整合所述SD序列的截短的HPV35型L1蛋白的核酸分子而得到。6.含有如权利要求2或3所述的编码核酸的表达盒或表达载体的重组宿主细胞。7.如权利要求6所述的重组宿主细胞，其特征在于，其是原核细胞，优选为大肠杆菌。8.一种表达如权利要求1截短的HPV35型L1蛋白的方法，其特征在于，培养如权利要求6或7所述的重组宿主细胞以产生HPV35型L1蛋白，任选地，包括纯化步骤，优选地所述纯化步骤为：取所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：伍树明，刘永江，陈晓，高文双，王学红，张海江，沈迩萃，薛俊莲，张尧，陈丹，银飞，王建英，
申请(专利权)人：北京康乐卫士生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：