一种抑制GRWD1基因的siRNA分子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抑制GRWD1基因的siRNA分子及其应用，属于生物医药技术领域。本发明专利技术首次揭示GRWD1在肝癌病人癌组织中表达高于癌旁组织，而本发明专利技术所提供GRWD1基因的siRNA分子能够有效抑制GRWD1表达，进而能够显著抑制肝癌细胞HepG2、Huh

【技术实现步骤摘要】
一种抑制GRWD1基因的siRNA分子及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，更具体地说，涉及一种抑制GRWD1基因的siRNA分子及其应用。

技术介绍

[0002]原发性肝癌世界范围内常见的恶性肿瘤，世界卫生组织2020统计结果表明世界范围内肝癌发病率第6、死亡率第3，在中国肝癌发病率位居第5位，死亡率仍高居第2位。对于早期肝癌，根治性手术是肝癌首选治疗方式，但是术后5年复发率高达70％。由于肝癌起病隐匿，加上肿瘤进展迅速，确诊时75％的HCC患者已经出现门静脉癌栓或发生远处转移等中晚期表现，失去手术根治性切除的机会，是影响我国肝癌总体疗效难以进一步提高的首要原因。目前绝大多数国内外指南推荐经动脉化疗栓塞(TACE)作为中期肝癌患者标准治疗方法。然而，临床上超过40％的患者对TACE没有客观应答。
[0003]肿瘤细胞的增殖、迁移及对化疗药物的耐受是导致肝癌治疗后复发转移的重要原因，抑癌基因P53的失活在人类肿瘤中非常常见，除了P53突变造成的失活外，野生型P53蛋白的稳定性降低也是肿瘤发生发展的一大诱因。肝癌中约50％的病人不发生P53的突变，但导致野生型P53不发挥作用的原因尚未完全揭示。
[0004]GRWD1基因编码一种含有5个WD
‑
重复基序的富含谷氨酸的核糖体蛋白，可能参与了核糖体的生物发生。已有的报道表明GRWD1作为负调控P53稳定性的重要因子，尚未有GRWD1在肝癌中的报道。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种抑制GRWD1基因的siRNA分子。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供前述抑制GRWD1基因的siRNA分子的在制备治疗肝癌药物中的应用。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0007]一种抑制GRWD1基因的siRNA分子，由如以下序列的正义链和反义链组成：
[0008]正义链：
[0009]反义链：
[0010]或
[0011]正义链：
[0012]反义链：
[0013]或
[0014]正义链：
[0015]反义链：
[0016]所述的siRNA分子在制备用于抑制GRWD1基因表达的药物中的应用。
[0017]进一步地，所述的应用中，所述药物是肝癌治疗药物。
[0018]进一步地，所述肝癌治疗药物包括治疗肝癌手术后复发、转移的治疗药物或肝癌经动脉化疗栓塞后复发、转移的治疗药物。
[0019]进一步地，所述肝癌治疗药物是降低肝癌细胞增殖、迁移能力和/或降低肝癌细胞对化疗药物半数抑制浓度的药物。
[0020]进一步地，所述化疗药物是顺铂。
[0021]进一步地，所述药物是注射剂、静脉注射剂或者液体口服剂。
[0022]相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0023]本专利技术首次发现GRWD1在数据库、肝癌和癌旁组织芯、肝癌和癌旁组织中片中癌组织表达高于癌旁组织。采用针对GRWD1的siRNA片段转染培养的肝癌细胞Hep
‑
G2、Huh
‑
7细胞的通过CCK8实验发现GRWD1促进Hep
‑
G2、Huh
‑
7细胞的增殖能力。利用Transwell迁移实验发现GRWD1促进Hep
‑
G2、Huh
‑
7细胞的迁移能力。利用梯度化疗药物顺铂处理，检测肝癌细胞对顺铂的敏感性发现GRWD1抑制Hep
‑
G2、Huh
‑
7细胞对顺铂敏感。表明GRWD1是促进肝癌发生发展的关键基因，可作为潜在的治疗靶点。也本专利技术所提供GRWD1基因的siRNA分子则可以用于制备抗肝癌治疗药物，具有重要的应用价值。
附图说明
[0024]图1为TCGA数据库和肝癌组织芯片中GRWD1癌组织和癌旁组织中的表达情况图，其中：图1A为GRWD1在TCGA数据库中的差异表达，图1B是GRWD1在组织芯片中的差异表达，图1C是GRWD1在8对肝癌和癌旁组织中的表达；
[0025]图2为siGRWD1在肝癌细胞HepG2、Huh
‑
7敲降效率的检测结果图；
[0026]图3为siGRWD1对肝癌细胞HepG2、和Huh
‑
7细胞增殖的影响结果图，其中：左图为对照和siGRWD1转染的HepG2细胞CCK8检测数据的统计，右图为对照和siGRWD1转染的Huh
‑
7细胞CCK8检测数据的统计；
[0027]图4为高倍显微镜下细胞迁移实验图(比例尺为50μm)，图4A为HepG2和Huh
‑
7细胞转染的si对照和siGRWD1的代表性图像，深色代表已迁移的HepG2或Huh
‑
7细胞；图4B为迁移速率统计结果；
[0028]图5为siGRWD1转染肝癌细胞HepG2和Huh
‑
7细胞对顺铂半数抑制浓度的影响图，其中：图5A、B为对照和siGRWD1转染的HepG2细胞IC50检测数据的统计，图5C、D为对照和siGRWD1转染的Huh
‑
7细胞IC50检测数据的统计。
具体实施方式
[0029]下面结合具体实施例对本专利技术进一步进行描述。
[0030]实施例1：
[0031]通过GEPIA肿瘤数据库查询肝细胞癌中GRWD1表达情况，如图1A为TCGA数据库中GRWD1在肝细胞癌癌组织(T)和癌旁组织(N)中的表达水平。结果显示GRWD1在肝细胞癌中高表达。
[0032]通过收集肝细胞癌患者术后病理标本，进行GRWD1免疫组化染色检测GRWD1在肝细胞癌癌组织和癌旁组织中蛋白的表达水平。如图1B所示GRWD1在肿瘤组织中高表达。免疫组
化主要步骤如下：
[0033]1)病理组织经烘片、脱蜡、水化、浸洗后使用碱性修复液进行高温抗原修复；
[0034]2)冷却后PBST洗瓶清洗再使用阻断剂进行封闭；
[0035]3)抗体稀释液稀释GRWD1一抗，室温孵育2h；
[0036]4)PBST洗片后室温孵育二抗1h；
[0037]5)PBST洗片后DAB显色及苏木素复染。
[0038]Western blot检测肝细胞癌患者癌组织和癌旁新鲜组织中蛋白的表达，结果如图1C所示，表明GRWD1在8对新鲜肝细胞癌肿瘤组织中高表达。新鲜组织Western blot主要步骤如下：
[0039]1)新鲜组织使用PBS清洗后使用组织裂解液裂解组织；
[0040]2)使用BCA蛋白定量试剂盒对提取蛋白进行定量；
[0041]3)使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白；
[0042]4)使用BSA进行封闭；
[0043]5)抗GRWD1一抗4℃孵育过夜；
[0044]6)二本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抑制GRWD1基因的siRNA分子，由如以下序列的正义链和反义链组成：正义链：5
′‑
GGGCAGUGAUGAAGAAGAATT
‑3′
，反义链：5
′‑
UUCUUCUUCAUCACUGCCCTT
‑3′
；或正义链：5
′‑
GGAUGAAGAAGAGCGGAAATT
‑3′
，反义链：5
′‑
UUUCCGCUCUUCUUCAUCCTT
‑3′
；或正义链：5
′‑
CGGACAGAGCUUCCUCUUATT
‑3′
，反义链：5
...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈爱国，吴雨萌，李媛媛，
申请(专利权)人：南通市肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：