一种基于CRISPR技术检测甘薯羽状斑驳病毒的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于CRISPR技术检测甘薯羽状斑驳病毒或甘薯病毒病的方法，所述方法包括利用gRNA、Cas蛋白和单链核酸检测器进行检测的步骤；本发明专利技术通过对gRNA的筛选和优化，提高了检测效率，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR技术检测甘薯羽状斑驳病毒的方法


[0001]本专利技术涉及核酸检测领域，尤其涉及基于CRISPR技术检测甘薯羽状斑驳病毒的方法、系统和试剂盒。

技术介绍

[0002]甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV)，又称为甘薯褐裂病毒、甘薯环斑病毒、甘薯叶斑病毒、甘薯内木栓病毒、甘薯病毒A，主要侵染旋花科甘薯属植物，如巴西牵牛、日本牵牛以及普通牵牛等。甘薯羽状斑驳病毒一般造成褪绿斑或具紫边的不明显或明显的褪绿斑(紫环斑)，也可沿叶脉形成紫色羽状斑纹，可经介体传播，如棉蚜、扁豆蚜、芥菜脂蚜和桃蚜等，也能靠机械接种传播和嫁接传播。特别重要的是，甘薯羽状斑驳病毒可与甘薯褪绿矮化病毒协生共侵染甘薯引起甘薯病毒病(sweet potato virus disease，SPVD)。甘薯病毒病是甘薯上是最严重的病毒病害之一，通常可使甘薯减产50％
‑
98％，甚至绝收。
[0003]甘薯羽状斑驳病毒的检测方法主要有：目测法、指示植物检测法、酶联免疫吸附法、免疫电镜法、RT
‑
PCR法。
[0004]本专利技术提供了一种新型的检测甘薯羽状斑驳病毒的方法，该方法是基于CRISPR技术，尤其是基于V型Cas酶的trans活性，提供的一种特异性高、检测灵敏度高的快速检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种基于CRISPR技术进行甘薯羽状斑驳病毒检测的方法、系统和试剂盒。
[0006]一方面，本专利技术提供了一种用于检测甘薯羽状斑驳病毒的gRNA，所述gRNA包括与Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述靶核酸为来源于甘薯羽状斑驳病毒的核酸。
[0007]本专利技术中，所述与CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域又称为同向重复序列、骨架区或spacer序列，该区域与Cas蛋白相互作用，从而结合Cas蛋白。
[0008]在一个实施方式中，所述gRNA自5
’
端至3
’
端依次包括与Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列。
[0009]在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有20
‑
30个碱基，并且与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交，并且所述导向序列包含SEQ ID No.3
‑
11任一所示的序列；优选的，所述导向序列包含SEQ ID No.3、4、5、6、7、8、9、10、11任一所示的序列。
[0010]在优选的实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有20
‑
30个碱基，例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基。
[0011]在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列包含SEQ ID No.3
‑
11任一所示
的序列，并且在SEQ ID No.3
‑
11任一所示的序列的3
’
端还包括1
‑
10个碱基(优选，1、2、3、4、5、6、7、8、9个碱基)，并且，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交；优选的，所述导向序列包含SEQ ID No.3、4、5、6、7、8、9、10、11任一所示的序列。
[0012]在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.3
‑
11任一所示的序列相比，在SEQ ID No.3
‑
11任一所示的序列的3
’
端连续缺失1
‑
5个碱基(例如，1、2、3、4、5个碱基)。
[0013]所述与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交，是指上述导向序列与SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的反向互补序列的连续的一段可以连续的互补配对。比如，所述与靶核酸杂交的导向序列含有30个碱基，则，导向序列的30个碱基需要与SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的互补序列的连续30个碱基互补配对。
[0014]在更优选的实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列如SEQ ID No.3
‑
11任一所示。
[0015]在一个实施方式中，所述Cas蛋白选自V型Cas蛋白，例如，Cas12、Cas14家族蛋白或其突变体。
[0016]在一个实施方式中，所述Cas蛋白优选为Cas12家族，包括但不限于Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j中的一种或任意几种。
[0017]优选的，所述与Cas蛋白结合的区域的序列如SEQ ID No.12所示。
[0018]另一方面，本专利技术提供了一种检测/诊断甘薯羽状斑驳病毒或甘薯病毒病的方法，所述方法包括将待测核酸与V型Cas蛋白、上述gRNA和单链核酸检测器接触；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测/诊断甘薯羽状斑驳病毒或甘薯病毒病。
[0019]在一个实施方式中，所述V型Cas蛋白选自以下任意一种：
[0020]I、所述V型Cas蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0021]II、所述V型Cas蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2相比，在对应于SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的第267位氨基酸存在突变。
[0022]在一个实施方式中，所述第267位氨基酸位点突变为非D的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，S，N，E，K，M，T，C，P，H，R，I；优选，所述第267位氨基酸突变为R。
[0023]应认识到，蛋白质可以以各种方式进行改变，包括氨基酸置换、删除、截短和插入，用于此类操作的方法是本领域通常已知的。例如，可以通过对DNA的突变来制备上述蛋白的氨基酸序列变体。还可以通过其他诱变形式和/或通过定向进化来完成，例如，使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，结合相关的筛选方法，来进行单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。领域技术人员能够理解，本专利技术Cas蛋白中的这些微小氨基酸变化可以出现(例如天然存在的突变)或者产生(例如使用r
‑
DNA技术)而不损失蛋白质功能或活性。如果这些突变出现在蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则多肽的性质可改变，但多肽可保持其活性。如果存在的突变不接近催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则可预期较小影响。
[0024]本领域技术人员可以根据本领域已知的方法，例如定位诱变或蛋白进化或生物信息系的分析，来鉴定本专利技术Cas突变蛋白的必需氨基酸。蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域也能够通过结构的物理分析而确定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体
学、电子衍射或光亲和标记，结合推定的关键位点氨基酸的突变来确定本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测甘薯羽状斑驳病毒的gRNA，所述gRNA包括与V型Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述靶核酸为来源于甘薯羽状斑驳病毒的核酸；其特征在于，所述与靶核酸杂交的导向序列选自下组任意一种或其组合：(1)所述与靶核酸杂交的导向序列含有20
‑
30个碱基，并且与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交，并且所述导向序列包含SEQ ID No.3
‑
11任一所示的序列；(2)所述与靶核酸杂交的导向序列包含SEQ ID No.3
‑
11任一所示的序列，并且在SEQ ID No.3
‑
11任一所示的序列的3
’
端还包括1
‑
10个碱基，并且，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交；(3)所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.3
‑
11任一所示的序列相比，在SEQ ID No.3
‑
11任一所示的序列的3
’
端连续缺失1
‑
5个碱基；(4)所述与靶核酸杂交的导向序列如SEQ ID No.3
‑
11任一所示。2.一种检测/诊断甘薯羽状斑驳病毒或甘薯病毒病的方法，所述方法包括将待测核酸与V型Cas蛋白、权利要求1所述的gRNA和单链核酸检测器接触；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测/诊断甘薯羽状斑驳病毒或甘薯病毒病。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述V型Cas蛋白选自以下I
‑
II任意一种：I、所述V型Cas蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；II、所述V型Cas蛋白的氨基酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丽梅，赵莹，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：