本发明专利技术涉及一种酿酒酵母通过丙氨酸途径生产丙二酸的方法，属于生物工程领域。本发明专利技术是以酿酒酵母为出发菌株，将来自角豆(Tribolium castaneum)的天冬氨酸脱羧酶基因(PAND)和来自蜡样芽孢杆菌的β丙氨酸丙酮酸转氨酶基因(BAPAT)整合到酿酒酵母BY4741基因组的delta位点上，在酿酒酵母中构建丙二酸合成途径，并替换该途径的上下游的细胞质天冬氨酸氨基转移酶和琥珀酸半醛脱氢酶的启动子为强组成型启动子，来进一步提高丙二酸产量本申请为酿酒酵母宿主中丙二酸的合成提供了新路线。重组酿酒酵母经摇瓶发酵后，丙二酸产量为4.4mg/L，5
【技术实现步骤摘要】
一种酿酒酵母通过丙氨酸途径生产丙二酸的方法
[0001]本专利技术涉及一种酿酒酵母通过丙氨酸途径生产丙二酸的方法，属于生物工程领域。
技术介绍
[0002]丙二酸(Malonic acid)又称胡萝卜酸、缩苹果酸或甜菜酸，分子结构中具有活性亚甲基和羧基两种官能团，因而可以参加各种化学反应，是非常重要的有机合成中间体。丙二酸是美国能源部公布的可以从生物质中生产的前30种化学品之一。
[0003]随着国内和国际化工行业的快速发展，丙二酸的产量和品质在日剧上升，丙二酸的用途和下游产品得到大力开发。
[0004]目前工业上常用水解氰乙酸或丙二酸酯的方法制备丙二酸，这些方法在制备过程中都会涉及到氰离子，而氰离子有剧毒，对环境危害大，反应过程复杂，需要经过复杂繁琐的提纯工序，导致产品收率低，原料纯度难以控制，三废处理困难，这些问题极大的限制了工业化生产的产能。
[0005]基于以上问题，越来越多的研究者选择通过细胞工厂生物合成丙二酸。常用的细胞有大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，毕赤酵母，酿酒酵母。Sang等人通过异源表达β丙氨酸丙酮酸转氨酶，在大肠杆菌中成功构建了以丙氨酸半醛为前体的丙二酸生产途径，产量达到3.6g/L。但是，以大肠杆菌作为宿主，存在菌体耐受性差、大肠杆菌毒性等问题，继而影响工业化生产的稳定性以及产品的适用范围。相比大肠杆菌，酿酒酵母是一种最简单的真核生物，其遗传背景清晰、基因操作容易、遗传稳定性强、生命力旺盛、耐酸性和抗逆性强，并且，酿酒酵母可以生产多种类型的有机酸，并且存在着许多支持有机酸合成的内源代谢途径，是大规模工业发酵生产的最常用菌株之一。在之前的研究中，Dietrich等人在酿酒酵母中发现，通过EHD3基因进行定点突变，其能够以丙二酰辅酶A为底物，转化为丙二酸，使在酿酒酵母中积累丙二酸成为可能，但是产量较低，无法满足工业化生产。
技术实现思路
[0006]基于以上问题，本专利技术通过在酿酒酵母中引入外源β丙氨酸丙酮酸转氨酶和天冬氨酸脱羧酶构建完整的从天冬氨酸到丙二酸的代谢途径，并将其整合到酿酒酵母delta位点和通过同源重组的方法将酿酒酵母基因组上启动细胞质天冬氨酸氨基转移酶和琥珀酸半醛脱氢酶表达的启动子替换为强启动子。
[0007]本专利技术首先提供了一种产丙二酸的重组酿酒酵母，所述重组酿酒酵母过表达β丙氨酸丙酮酸转氨酶基因(BAPAT)和天冬氨酸脱羧酶基因(PAND)，并强化表达了细胞质天冬氨酸氨基转移酶和琥珀酸半醛脱氢酶。
[0008]在一种实施方式中，启动子GPD启动BAPAT基因的表达，启动子TEF1启动PAND基因的表达。
[0009]在一种实施方式中，所述强化表达为通过启动子TEF1启动编码细胞质天冬氨酸氨
基转移酶基因的表达，通过启动子GPD启动编码琥珀酸半醛脱氢酶基因的表达。
[0010]在一种实施方式中，所述天冬氨酸脱羧酶来自角豆(Tribolium castaneum)，所述β丙氨酸丙酮酸转氨酶来自蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。
[0011]在一种实施方式中，所述PAND基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述BAPAT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，启动子TEF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，启动子GPD的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0012]在一种实施方式中，所述重组酿酒酵母以酿酒酵母BY4741为出发菌株。
[0013]本专利技术的第二个目的是提供一种构建所述重组酿酒酵母的方法，包括以下步骤：
[0014](1)将过表达框HTA
‑
1整合到酿酒酵母BY4741基因组上，构建得到重组菌BA
‑
1；
[0015](2)将过表达框LGU
‑
1整合到步骤(1)的重组菌BA
‑
1基因组上，构建得到重组菌BA
‑
2；
[0016](3)将这个片段DBU
‑
1片段和DPU
‑
1片段整合到步骤(2)的重组菌BA
‑
2基因组上，构建得到重组菌BA
‑
3。
[0017]在一种实施方式中，所述DBU
‑
1片段由Delta1、GPD启动子、基因BAPAT、CYC1终止子和Ura1组成；所述DPU
‑
1片段由Ura2、TEF1启动子、PAND基因、ADH终止子和Delta2组成。
[0018]本专利技术的第三个目的是提供一种生产丙二酸的方法，所述方法为，以葡萄糖为碳源，利用上述重组酿酒酵母进行发酵。
[0019]在一种实施方式中，将上述重组酿酒酵母的种子液以体积比1～3％的接种量接种到培养基中，于28～30℃培养72～168h。
[0020]在一种实施方式中，所述培养基包括葡萄糖15～25g/L，酵母提取物5～15g/L和蛋白胨15～25g/L
[0021]本专利技术的第四个目的是提供一种提高酿酒酵母胞外分泌丙二酸的方法，所述方法为过表达β丙氨酸丙酮酸转氨酶基因(BAPAT)和天冬氨酸脱羧酶基因(PAND)，并强化表达了细胞质天冬氨酸氨基转移酶和琥珀酸半醛脱氢酶。
[0022]在一种实施方式中，启动子GPD启动BAPAT基因的表达，启动子TEF1启动PAND基因的表达。
[0023]在一种实施方式中，所述强化表达为通过启动子TEF1启动编码细胞质天冬氨酸氨基转移酶基因的表达，通过启动子GPD启动编码琥珀酸半醛脱氢酶基因的表达。
[0024]在一种实施方式中，所述天冬氨酸脱羧酶来自角豆(Tribolium castaneum)，所述β丙氨酸丙酮酸转氨酶来自蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。
[0025]在一种实施方式中，所述PAND基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述BAPAT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，启动子TEF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，启动子GPD的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0026]本专利技术还提供所述重组酿酒酵母或所述生产丙二酸的方法在制备丙二酸或其衍生产品方面的应用。
[0027]有益效果
[0028]1、本专利技术是以酿酒酵母为出发菌株，将来自角豆(Tribolium castaneum)的天冬氨酸脱羧酶基因(PAND)和来自蜡样芽孢杆菌的β丙氨酸丙酮酸转氨酶基因(BAPAT)整合到酿酒酵母BY4741基因组的delta位点上来构建丙二酸合成途径。同时通过替换该途径的上
下游细胞质天冬氨酸氨基转移酶和琥珀酸半醛脱氢酶的启动子为强组成型启动子，构建获得高产丙二酸的重组酿酒酵母，为酿酒酵母宿主中丙二酸的合成提供了新路线。
[0029]2、本申请构建的重组酿酒酵母经摇瓶发酵后，丙二酸产量为4.4mg/L，在5
‑
L发酵罐中，丙二酸最高产量为44.31mg/L。
...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种产丙二酸的重组酿酒酵母，其特征在于，过表达β丙氨酸丙酮酸转氨酶基因BAPAT和天冬氨酸脱羧酶基因PAND，并强化表达细胞质天冬氨酸氨基转移酶和琥珀酸半醛脱氢酶；启动子GPD启动BAPAT基因的表达，启动子TEF1启动PAND基因的表达。2.如权利要求1所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述强化表达为通过启动子TEF1启动编码细胞质天冬氨酸氨基转移酶基因的表达，通过启动子GPD启动编码琥珀酸半醛脱氢酶基因的表达。3.如权利要求1所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述PAND基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述BAPAT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，启动子TEF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，启动子GPD的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。4.如权利要求1～3任一所述的重组酿酒酵母，其特征在于，以酿酒酵母BY4741为出发菌株。5.一种丙二酸的生产方法，其特征在于，以葡萄糖为碳源，利用权利要求1～4任一所述的重组酿酒酵母进行发酵。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓禹，赵运英，李诗韵，李国辉，周胜虎，毛银，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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