一种靶向治疗结核病的ESAT6-CAR-T及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于结核病免疫治疗领域，具体涉及一种靶向治疗结核病的ESAT6

【技术实现步骤摘要】
一种靶向治疗结核病的ESAT6
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CAR
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T及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于结核病免疫治疗领域，具体涉及一种靶向治疗结核病的ESAT6
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CAR
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T及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]结核病(tuberculosis)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的高致死性传染病，至今仍是造成死亡人数最多的单一传染病。近年来发病率持续增加，全球每年新发病例近900万、死亡病例约200万，尽管我国在肺结核防控及诊疗方面取得了一定的成绩，但中国仍是结核病高负担国家之一。
[0003]结核病的治疗目前仍以传统的化学药物治疗为主，但结核药物在临床应用中暴露出诸多短板，例如：现行结核药物治疗周期长、易引发细菌耐药；结核药物(异烟肼、利福平等)毒副作用明显、一定程度上削弱了患者自身机体免疫力。此外Mtb这种古老的细菌寄生在宿主细胞内遇到特殊环境(营养缺乏、极端pH)会处于休眠态，这进一步减弱了传统药物的敏感性及杀伤能力。在上述要素的催化下，患者机体不能够产生足够的免疫应答与特异的免疫保护，而结核病的治愈与转归极大程度上依赖病人自身的免疫状态。
[0004]结核药物的长期使用使得耐药问题愈发严重，引发了不同种类的耐药(单耐药；多耐药；广泛耐药等)，给结核病的临床治疗带来了巨大的挑战。目前应对的方式依然为传统的化学药物疗法，在治疗效果极其有限同时，又造成了极大的毒副作用。不同程度损害了患者机体免疫力。患者自身免疫力影响着结核疾病的发生发展及转归。国内外研究视角动态转移到结核病的免疫治疗中，旨在纠正炎症反应，缩短治疗进程和提高疗效。多项研究显示了免疫治疗在结核病治疗的广阔前景。但是目前免疫制剂种类繁多，且多为外源制剂，存在一定的生物安全及隐患。因此避开传统药物、纠正患者免疫状态，开发新的免疫治疗方案对于解决Mtb感染至关重要。
[0005]嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cell,CAR
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T)是一种新型高效的基因工程免疫细胞治疗制剂，是将识别特定抗原蛋白的嵌合抗原受体(CAR)借助病毒载体表达并锚定在细胞膜上，起到靶向识别、特异杀伤靶细胞的作用。起初应用于肿瘤的治疗，并在血液肿瘤的治疗中大放异彩，取得了很大的成功，在临床实验及多项研究中都呈现了良好的靶向性及特异性。结核分枝杆菌作为胞内寄生菌，机体内的清除需要固有免疫与获得性免疫的协作。经Mtb感染的抗原呈递细胞会呈递多种特有抗原，表明CAR
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T细胞疗法对于Mtb感染具有良好的应用价值。
[0006]Mtb的菌体成分、分泌蛋白等多种成分可以激发患者机体的免疫功能，存在诸多理想的靶点抗原(Ag85、CFP
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10)。其中ESAT6富含T细胞抗原表位，是公认的特异性靶蛋白且与其他分枝杆菌无交叉原性。而且已有多项研究针对该靶点开发拮抗药物，具有较高的应用价值。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的不足，本专利技术提供一种靶向治疗结核病的ESAT6
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CAR
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T及其制备方法和应用，以ESAT6为靶点抗原通过杂交瘤技术及测序技术获得高亲和力的特异性单链抗体(scFv)并进一步设计CAR
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T细胞。通过识别ESAT6这一靶点抗原，利用CAR
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T细胞与Mtb感染的细胞的协同机制，绕过化疗耐药机制，最大限度的激发患者自身免疫系统，解决免疫低下和胞内潜伏，利用细胞协同机制杀灭Mtb实现结核病治疗目的。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：一种靶向治疗结核病的ESAT6
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CAR
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T，所述ESAT6
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CAR
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T的保藏编号为CCTCC NO:C2022374，分类命名：人源ESAT6
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CAR
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T淋巴细胞2022H
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ECT1。保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期2022年12月08日。
[0009]进一步的，所述ESAT6
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CAR
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T对Mtb
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ESAT6抗原特异性靶向、利用CD4
+
和CD8
+
联合识别并杀伤Mtb宿主细胞。
[0010]靶向治疗结核病的ESAT6
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CAR
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T的制备方法，所述制备方法包括：
[0011]步骤1：Mtb特异性分泌抗原ESAT6的克隆、表达、纯化与免疫；
[0012]步骤2：抗ESAT6蛋白特异性单链抗体氨基酸编码序列的研制与筛选；
[0013]步骤3：携带抗ESAT6蛋白单链抗体序列的慢病毒及逆转录病毒的制备；
[0014]步骤4：ESAT6
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CAR
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T淋巴细胞的制备。
[0015]进一步的，所述步骤1具体包括：
[0016](1)根据Mtb的ESAT6蛋白氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏好性，优化密码子并设计引物，扩增ESAT6全长片段并插入载体pET
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22b构建重组质粒pET22b
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ESAT6，利用双酶切及测序进行鉴定；
[0017](2)将鉴定正确的重组质粒pET22b
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ESAT6转化入BL21感受态细胞中并进行IPTG诱导表达，收集诱导后菌体、超声破碎并制备蛋白样品，SDS
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PAGE电泳分析蛋白表达及表达形式，优化诱导条件后，制备样品进行Ni柱亲和层析纯化，纯化后样品经SDS
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PAGE电泳分离后，转膜并孵育His标签抗体，洗膜后孵育HRP标记的二抗，而后进行显色及曝光；
[0018](3)将鉴定正确的ESAT6重组蛋白与佐剂混合乳化，按照100μg/只的剂量经皮下多点注射免疫Balb/c小鼠，2
‑
3周加强免疫一次，总共5次免疫，鼠尾采血后通过ELISA检测抗体效价。
[0019]进一步的，所述步骤2具体包括：
[0020]免疫过的Balb/c小鼠无菌取脾，并制备单细胞悬液，利用半固体与液相结合的方式进行细胞融合，筛选杂交瘤细胞，通过ELISA鉴定并筛选分泌抗体的阳性杂交瘤细胞，对符合预期的杂交瘤细胞扩大培养及冻存，并对单克隆抗体进行亚型鉴定，鉴定后将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，以期制备大量单克隆抗体，随后收集小鼠腹水，经proteinG亲和层析得到抗体，并将相对应的杂交瘤细胞进行测序。
[0021]进一步的，所述步骤3具体包括：
[0022]将筛选得到的序列与病毒载体质粒相连接，并转化入宿主菌，挑取阳性克隆后进行目的序列PCR及测序，将鉴定正确的病毒重组载体连本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向治疗结核病的ESAT6
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CAR
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T，其特征是：所述ESAT6
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CAR
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T的保藏编号为CCTCC NO:C2022374。2.根据权利要求1所述的靶向治疗结核病的ESAT6
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CAR
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T，其特征在于：所述ESAT6
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CAR
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T对Mtb
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ESAT6抗原特异性靶向、利用CD4
+
和CD8
+
联合识别并杀伤Mtb宿主细胞。3.根据权利要求1
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2任一项所述的靶向治疗结核病的ESAT6
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CAR
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T的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括：步骤1：Mtb特异性分泌抗原ESAT6的克隆、表达、纯化与免疫；步骤2：抗ESAT6蛋白特异性单链抗体氨基酸编码序列的研制与筛选；步骤3：携带抗ESAT6蛋白单链抗体序列的慢病毒及逆转录病毒的制备；步骤4：ESAT6
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CAR
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T淋巴细胞的制备。4.根据权利要求3所述的靶向治疗结核病的ESAT6
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CAR
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T的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体包括：(1)根据Mtb的ESAT6蛋白氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏好性，优化密码子并设计引物，扩增ESAT6全长片段并插入载体pET
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22b构建重组质粒pET22b
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ESAT6，利用双酶切及测序进行鉴定；(2)将鉴定正确的重组质粒pET22b
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ESAT6转化入BL21感受态细胞中并进行IPTG诱导表达，收集诱导后菌体、超声破碎并制备蛋白样品，SDS
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PAGE电泳分析蛋白表达及表达形式，优化诱导条件后，制备样品进行Ni柱亲和层析纯化，纯化后样品经SDS
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PAGE电泳分离后，转膜并孵育His标签抗体，洗膜后孵育HRP标记的二抗，而后进行显色及曝光；(3)将鉴定正确的ESAT6重组蛋白与佐剂混合乳化，按照100μg/只的剂量经皮下多点注射免疫Balb/c小鼠，2
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3周加强免疫一次，总共5次免疫，鼠尾采血后通过ELISA检测抗体效价。5.根据权利要求3所述的靶向治疗结核病的ESAT6
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CAR
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T的制备方法，其特征在于：所述步骤2具体包括：免疫过的Balb/c小鼠无菌取脾，并制备单细胞悬液，利用半固体与液相结合的方式进行细胞融合，筛选杂交瘤细胞，通过ELISA鉴定并筛选分泌抗体的阳性杂交瘤细胞，对符合预期的杂交瘤细胞扩大培养及冻存，并对单克隆抗体进行亚型鉴定，鉴定后将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，以期制备大量单克隆抗体，随后收集小鼠腹水，经proteinG亲和层析得到抗体，并将相对应的杂交瘤细胞进行测序。6.根据权利要求3所述的靶向治疗结核病的ESAT6
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CAR
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T的制备方法，其特征在于：所述步骤3具体包括：将筛选得到的序列与病毒载体质粒相连接，并转化入宿主菌，挑取阳性克隆后进行目的序列PCR及测序，将鉴定正确的病毒重组载体连同辅助质粒共转染293T细胞，依据细胞生长状态，收集转染后293T细胞上清，将含有病毒的上清浓缩保存，以备后续实验。7.根据权利要求3所述的靶向治疗结核病的ESAT6
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CAR
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T的制备方法，其特征在于：所述步骤4具体包括：健康成人外周血分离PBMC细胞，并通过磁珠阴选分离纯化CD3
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T细胞，终浓度为25g/mL的ConA刺激CD3
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T细胞，激活24h后加入慢病毒进行转染得到ESAT6
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CAR
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T细胞。8.根据权利要求3所述的靶向治疗结核病的ESAT6
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CAR
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T的制备方法，其特征在于：所
述步骤4具体包括：一、人外周血CD3
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T细胞分选及体外激活：(1)采集新鲜的EDTA抗凝全血，颠倒混匀；(2)将新鲜采集的抗凝全血用PBS按照1:1的体积比进行稀释并充分混匀；(3)将...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊正君，付玉荣，赵荣兰，乔晋娟，李恒，孟祥英，张湘涓，徐海山，
申请(专利权)人：潍坊医学院，
类型：发明
国别省市：