一种检测呋喃妥因代谢物的核酸适配体及其试剂盒使用方法技术

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，具体是一种检测呋喃妥因代谢物的核酸适配体及其试剂盒使用方法。一种检测呋喃妥因代谢物的核酸适配体，核酸适配体的序列为核苷酸序列表记载的AHD

【技术实现步骤摘要】
一种检测呋喃妥因代谢物的核酸适配体及其试剂盒使用方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，具体是一种检测呋喃妥因代谢物的核酸适配体及其试剂盒使用方法。

技术介绍

[0002]呋喃妥因属于硝基呋喃类药物，是一种重要的广谱抗菌药物，对大多数革兰氏细菌、真菌和原虫等病原体均有杀灭作用，曾广泛用于预防和治疗水产、家禽等动物的传染病和胃肠道疾病，还被用作饲料添加剂，促进动物生长。随着研究的深入发现呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮等母体药物在动物体内的半衰期很短，可以快速代谢，但代谢物可以与动物体内的蛋白质紧密结合，形成稳定的残留物1
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氨基乙内酰脲，当人们食用了含有硝基呋喃类药物残留的食品后，会对身体产生一系列不良反应并具有潜在的致畸性和致突变性。为了保证动物源性食品的安全，许多国家畜牧业领域已禁止此类药物使用。由于呋喃妥因具有抗菌谱广、价格低廉等优点，一些养殖人员在经济利益等驱使下仍有违法使用。为了控制兽药残留，保障食品安全，有必要建立一种快速、有效的分析方法对1
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氨基乙内酰脲进行检测。
[0003]1‑
氨基乙内酰脲的检测方法较多，包括高效液相色谱、液相色谱
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串联质谱、毛细管区带电泳、化学发光酶免疫测定和酶联免疫吸附测定。高效液相色谱法是目前最常用的AHD检测方法，具有较高的灵敏度和特异性。然而，高效液相色谱和液相色谱
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串联质谱需要昂贵的实验设备，并需要专业的操作人员来执行，不利于大量样品的检测。毛细管区带电泳也需要昂贵的实验设备，操作繁琐。化学发光酶免疫测定和酶联免疫吸附测定受到制备抗体的限制，抗体的性能和特异性决定了测定方法的准确性。这些常用的方法都无法达到更广泛、更简单、更经济的检测要求，因此，研究出满足食品检测要求的高灵敏、高特异性的检测方法，加强对此类药物残留检测和控制有着十分紧迫的现实意义。
[0004]近年来，在检测领域出现了一种新型的核酸探针：核酸适配体(简称：适配体)。适配体又被称为“化学抗体”，相比于传统的抗体有着诸多的优势，比如：化学性质稳定，易修饰，筛选时间短，不需要经过动物实验等。适配体通过指数富集的配体系统进化(SELEX)得到，具有高亲和力和高特异性，能够与目标分子特异性结合，已被用于检测多种物质，如：金属离子、抗生素、毒素、细胞、病毒、蛋白质等。适配体已经广泛应用于生物医药行业以及食品环境检测等领域。目前已经证实适配体在特定的缓冲液体系下可以折叠成独特的空间结构，这种结构可以通过范德华力、氢键和疏水作用与目标分子特异性紧密结合。
[0005]目前暂无关于适配体传感器检测AHD的报道，并且适配体通常由氧化石墨烯(GO)
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SELEX、MB
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SELEX、细胞
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SELEX得到，目前暂无关于MC
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SELEX富集小分子适配体的报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术为克服上述情况不足，旨在提供一种能解决上述问题的技术方案。
[0007]一种检测呋喃妥因代谢物的核酸适配体，核酸适配体的序列为核苷酸序列表记载
的AHD
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No.1：AHD8，AHD
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No.2：AHD12，AHD
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No.3：AHD33，AHD
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No.4：AHD50，以及所述核酸适配体经过修饰或改造后得到的适配体衍生物；核酸适配体由单链DNA组成，且5
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末端标记FAM荧光基团。
[0008]进一步的，核酸适配体通过以下方法制备：
[0009]S11：通过非固定的MC
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SELEX筛选方法，得到AHD的候选序列；
[0010]S12：通过对候选序列进行一级结构、二级结构、三级结构进行分析得到候选的核酸适配体；
[0011]S13：通过荧光法测定、分子对接技术、分子动力学模拟技术得到核酸适配体的核心识别区域。
[0012]一种基于以上所述一种检测呋喃妥因代谢物的核酸适配体的检测试剂盒使用方法，包括以下步骤：
[0013]S21：设置含核酸适配体的试剂盒；
[0014]S22：获取代谢物样品并对其进行预处理；
[0015]S23：将处理好的呋喃妥因代谢物样品放入试剂盒中摇匀60min(分钟)；
[0016]S24：向试剂盒中加入氧化石墨烯，继续摇匀10min；
[0017]S25：离心静置后吸取上层清液并测荧光值。
[0018]进一步的，步骤S21所设置的试剂盒包括以下组分：荧光标记的核酸适配体、结合缓冲液。
[0019]进一步的，步骤S22中所获取代谢物样品为养殖水。
[0020]与现有技术相比，本专利技术取得的有益效果为：
[0021](1)本专利技术基于适配体构建的核酸适配体用于检测AHD，灵敏度高、操作简单、选择性强、速度快、价格低廉，在AHD检测中具有良好的应用前景。
[0022](2)本专利技术首次提出通过非固定的MC
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SELEX筛选得到适配体序列进行分析并优化，得到了适配体的核心识别区域，通过体外克隆合成了对AHD有高亲和力和特异性的适配体。
[0023](3)本专利技术基于AHD的适配体和氧化石墨烯(GO)构建了荧光适配体传感器。当检测体系中有AHD时，适配体特异性的结合AHD，不会通过π
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π堆积被氧化石墨烯(GO)吸附。当AHD的浓度不同时，其检测到的荧光值也不一样，而当检测体系中不含AHD时，荧光标记的适配体就会通过π
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π堆积被氧化石墨烯(GO)吸附。基于此原理，实现了AHD的定量检测。
[0024](4)本专利技术针对传统的检测方法不能够检测大规模的样品、操作繁琐，以及免疫分析方法中的抗体制备需要长时间的动物实验，建立了基于氧化石墨烯(GO)的荧光传感器快速检测方法，可用于实际样品中AHD残留的快速和灵敏的定量检测，并且克服了上述方法的缺陷。为样品中抗生素的检测提供了新的检测方法。
[0025](5)本专利技术基于氧化石墨烯(GO)对AHD适配体进行了筛选及序列优化，构建了基于氧化石墨烯(GO)的荧光适配体传感器，在实际样本养殖水和湖水中成功检出，线性关系好，对AHD的检测开发产品方面奠定了基础。
[0026]本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。
附图说明
[0027]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0028]图1为本专利技术核酸适配体的工作原理示意图；
[0029]图2为本专利技术中浓度
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荧光强度关系图...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测呋喃妥因代谢物的核酸适配体，其特征在于，核酸适配体的序列为核苷酸序列表记载的AHD
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No.1：AHD8，AHD
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No.2：AHD12，AHD
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No.3：AHD33，AHD
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No.4：AHD50，以及所述核酸适配体经过修饰或改造后得到的适配体衍生物；核酸适配体由单链DNA组成，且5
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末端标记FAM荧光基团。2.根据权利要求1所述一种检测呋喃妥因代谢物的核酸适配体，其特征在于，核酸适配体通过以下方法制备：S11：通过非固定的MC
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SELEX筛选方法，得到AHD的候选序列；S12：通过对候选序列进行一级结构、二级结构、三级结构进行分析得到候选的...

【专利技术属性】
技术研发人员：乐涛，郑晓玲，向文煜，曹明冬，谢永，
申请(专利权)人：重庆师范大学，
类型：发明
国别省市：