车叶草苷在成骨细胞系MC3T3-E1增殖与分化的应用制造技术

本发明专利技术涉及车叶草苷的新用途，具体是车叶草苷在成骨细胞系MC3T3

【技术实现步骤摘要】
车叶草苷在成骨细胞系MC3T3
‑
E1增殖与分化的应用


[0001]本专利技术涉及车叶草苷的新用途，具体是车叶草苷在成骨细胞系MC3T3
‑
E1增殖与分化中的应用。

技术介绍

[0002]骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是以骨质减少、骨组织细微结构破坏、骨脆性增加、骨折危险性增大为特征的全身性的慢性代谢性骨病，被世界卫生组织列为仅次于心血管系统疾病的第二大危害人类健康的疾病。根据国际骨质疏松基金会的数据显示，在全球范围内超过50岁的人群中有三分之一的女性和五分之一的男性会发生骨质疏松性骨折。鉴于许多国家人口老龄化正在迅速增加，骨质疏松症患者逐渐增多，骨质疏松症己成为全球范围内广泛存在的严重社会公众健康问题。因此，如何预防以及治疗质疏松症将成为一项重要课题。
[0003]骨质疏松症的主要原因是骨形成和骨吸收失衡。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。骨组织不断地进行着重建，骨重建过程包括成骨细胞形成新骨和破骨细胞吸收旧骨。正常情况下成骨细胞和破骨细胞所介导的骨形成和骨吸收处于平衡状态，在病理条件下平衡打破即可引起骨代谢异常而引发相关疾病，如骨质疏松症。因此，破骨与成骨过程的平衡是维持正常骨量的关键。目前，骨质疏松症治疗药物主要分为两类：抑制骨吸收和促进骨形成，其中甲状旁腺激素是美国食品药品监督管理局唯一批准的促进骨形成的药物，但是甲状旁腺激素可以引发骨肉瘤，导致其在临床上大规模应用受到限制。
[0004]车叶草苷(Asperuloside,Asp)是一种环烯醚萜类化合物，目前，国内外的研究发现，车叶草苷具有抗炎、镇痛、降血压、抗肿瘤等广泛天然药理作用。车叶草苷作为一种已经有的物质，尽管有确切的分子式和结构式，但其研究的活性不高，作为单体在促进成骨细胞增殖、治疗骨质疏松症中的应用还未见报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供车叶草苷在成骨细胞系MC3T3
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E1增殖与分化药物中的应用。
[0006]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了车叶草苷在制备成骨细胞系MC3T3
‑
E1增殖与分化药物中的应用。
[0008]车叶草苷的结构式如下：
[0009][0010]上述技术方案中，进一步地，所述药物为治疗或预防骨质疏松的药物。
[0011]本专利技术还提供了车叶草苷在制备预防骨质疏松保健食品中的应用。
[0012]上述技术方案中，进一步地，所述车叶草苷的浓度为5～20μM；优选地，所述车叶草苷的浓度为10～20μM。
[0013]本专利技术提供了一种预防或治疗骨质疏松的药物，所述药物以车叶草苷为活性成分。
[0014]上述技术方案中，进一步地，所述药物以车叶草苷为唯一活性成分。
[0015]上述技术方案中，进一步地，所述药物为口服制剂或注射制剂。
[0016]本专利技术提供了一种预防骨质疏松的保健食品，所述保健食品包含车叶草苷。
[0017]本申请采用的实验验证方法如下：
[0018](1)用浓度分别为5、10、20μM的车叶草苷处理MC3T3
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E1细胞24、48、72h，并采用CCK
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8试剂盒检测MC3T3
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E1细胞活力、ALP试剂盒检测ALP活性；
[0019](2)用浓度分别为5、10、20μM的车叶草苷处理MC3T3
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E1细胞72h后，用real time PCR法检测细胞中OPG和RANKL mRNA表达水平；骨保护素(OPG)是由成骨细胞合成的一种参与骨重建的糖蛋白，其通过阻断RANK与RANKL之间的相互作用抑制破骨细胞的活性，阻碍骨吸收。所以，OPG/RANKL表达比值是骨量的主要决定因素，是评价骨形成的重要标志，并且在大多数骨溶解疾病的诊断治疗中有着重要的意义。
[0020](3)用浓度分别为5、10、20μM的车叶草苷处理MC3T3
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E1细胞72h后，继续用条件培养液培养17d，然后用Von Kossa染色法检测MC3T3
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E1细胞产生矿化结节情况。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的有益效果：
[0022]本专利技术通过体外实验和分子生物学实验证明了车叶草苷可以促进MC3T3
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E1细胞增殖与分化，使ALP活性增高，上调OPG/RANKL的比值，促进骨的形成以及矿化结节的生成，探索并提供了车叶草苷促进成骨细胞增殖与分化的机制。本专利技术为车叶草苷在骨质疏松症的治疗与预防提供了理论依据。
附图说明
[0023]图1不同浓度Asp促进MC3T3
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E1细胞增殖结果图；
[0024]图2不同浓度Asp对MC3T3
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E1细胞中ALP活性的影响结果图；
[0025]图3不同浓度Asp对MC3T3
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E1细胞中OPG/RANKL mRNA表达情况的影响结果图；
[0026]图4不同浓度Asp对MC3T3
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E1的细胞矿化结节形成影响结果图。
具体实施方式
[0027]以下结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，但不以任何方式限制本专利技术。
[0028]以下实施例中所用细胞、试剂、器材均可通过商业渠道购买得到。
[0029]实施例1
[0030]1、实验方案：
[0031]①
细胞增殖能力的检测
[0032]MC3T3
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E1细胞以1
×
105/ml个细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl细胞悬液。待细胞贴壁后，弃去原细胞培养液，加入不同浓度的Asp(5μM、10μM和20μM)，每孔100μl。细胞继续在体积分数为5％ CO2、37℃的细胞培养箱中继续培养24h、48h和72h，然后每孔加入10μl的CCK
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8溶液，继续培养0.5h。用酶标仪测定450nm的OD值。
[0033]②
碱性磷酸酶(ALP)活性检测
[0034]MC3T3
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E1细胞以2
×
105/ml个细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔300μl细胞悬液。待细胞贴壁后，弃去原细胞培养液，加入条件培养液(含有50μg/ml维生素C、10mMβ
‑
甘油磷酸钠的DMEM细胞培养液)，每孔300μl，在体积分数为5％ CO2、37℃的细胞培养箱中继续培养7d，每天换液一次。然后弃去原细胞培养液，加入不同浓度的Asp(5μM、10μM和20μM)药液，每孔300μl。培养24h、48h和72h后，按照ALP试剂盒说明书测定ALP含量，BCA试剂盒测定蛋白总含量，并且按照ALP试剂盒说明中提供的公式计算ALP含量。
[0035]③
Real
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.车叶草苷在制备成骨细胞系MC3T3
‑
E1增殖与分化药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为治疗或预防骨质疏松的药物。3.车叶草苷在制备预防骨质疏松保健食品中的应用。4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述车叶草苷的浓度为5～20μM。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述车叶草苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：张春芳，王艳，张朋新，孙美玉，季佳霖，贾文婷，贺军，
申请(专利权)人：大连医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：