一种转基因智能不育系材料及其后代中内、外源基因的检测引物和鉴定方法技术

本发明专利技术提供了一种转基因智能不育系材料及其后代中内、外源基因的检测引物和鉴定方法，属于植物生物技术领域。本发明专利技术的检测引物包含一条正向引物SEQ ID NO.1和两条反向引物SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。利用本发明专利技术的引物，只需通过常规的PCR和PAGE胶电泳即可区分转基因材料及其自交、杂交、回交后代中的内、外源基因，以及各种内、外源基因组成的基因型，从而在转基因材料当代和后代的繁殖及转育过程中，提高对目标基因型的选择效率。本发明专利技术提供的方法操作简便、分型快速、结果直观准确，在植物育种技术领域中应用前景广阔。技术领域中应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
一种转基因智能不育系材料及其后代中内、外源基因的检测引物和鉴定方法


[0001]本专利技术涉及植物分子遗传育种
，具体地涉及一种鉴别转基因智能不育系水稻及其自交、杂交、回交后代中内、外源GMS2基因型的分子标记及其应用。

技术介绍

[0002]水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是我国的主要粮食作物。雄性不育是指雄性生殖器官无法产生正常花粉，而雌性生殖器官发育正常，能接受正常花粉而受精结实的现象。水稻是自花授粉作物，利用雄性不育迫使水稻接受外来花粉，既可以利用杂种优势提高水稻的产量、品质和抗性，又可以实现大规模杂交种制备，在杂交水稻产业中具有十分重要的意义。海南波莲水稻基因科技有限公司于2013年用钴60对籼稻材料9311进行辐射，筛选获得一份隐性核雄性不育材料，命名为gms2。该突变性状由GMS2基因在基因编码区第118位～126位的AACAGCTAC碱基发生缺失，导致LOC_Os04g48490基因编码蛋白的第40、41和42位的天冬酰胺、丝氨酸和酪氨酸缺失。
[0003]GAT(Genetic Automation Technology，GAT)技术是一种新型的杂交种子育制种技术，该技术可成功利用隐性核雄性不育系，其核心思路是利用现代生物技术，将农作物花粉育性恢复基因、花粉败育基因、除草剂敏感基因、筛选标记基因等按特定顺序和方向紧密连锁地构建在GAT载体上，通过高通量基因转化技术导入到隐性核雄性不育系中，获得大量转化事件。由于多基因转化过程中经常出现部分基因转入、各转基因元件无法同时发挥功能及转基因沉默等问题，故多基因转化经常出现无法筛选获得均达目的性状的转化事件。经过对各功能元件的筛选，获得元件均发挥正常功能的初始保持系，创造隐性核雄性不育系的保持系，用于GAT不育系和杂交种的生产，从而成功实现隐性核雄性不育系的保持和繁殖，进而实现隐性核雄性不育系的商业化利用。在将上述gms2突变体及相应的GMS2突变基因用于GAT杂交水稻技术的研发过程中，如何有效区分转基因植株及其自交、杂交、回交后代中外源GMS2转基因(即育性恢复基因)、内源野生型GMS2基因和内源突变型GMS2基因成为一个需要克服的问题。
[0004]转基因检测大致分为基于转基因植物的核酸水平检测和蛋白水平检测两类(Querci M,Van den Bulcke M(2010)New approaches in GMO detection.Anal Bioanal Chem 396(6):1991
‑
2002)。其中，基于核酸水平的检测具有检测方便、体系成熟、可检测范围广及通量高等特点，因此使用较为广泛(Elenis D,Kalogianni D(2008)Advances in molecular techniques for the detection and quantification of genetically modified organisms.Anal Bioanal Chem 392(3):347
‑
54)。基于核酸水平的检测方法按具体应用又可以分为以下几种：1、传统定性PCR检测技术；2、荧光定量PCR检测技术；3、多重PCR检测技术；4、核酸杂交检测技术；5、基因芯片检测技术等。
[0005]为了解决在转基因植株及其自交、杂交、回交后代中有效区分外源GMS2转基因、内源野生型和突变型GMS2基因及其组合的问题，本专利技术通过在外源GMS2转基因中引入SNP，并
结合gms2中GMS2基因的突变位点，设计引物，通过传统PCR即实现了对转基因材料及其后代中内、外源基因的基因定性分型。本鉴定方法操作简便，成本低廉，通量可控，特别适合小、微企业的研究和生产需要。

技术实现思路

[0006]本专利技术的本专利技术的第一个目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种鉴别转基因水稻及其自交、杂交、回交后代中内、外源GMS2基因的分子标记和引物组合。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供利用上述标记和引物组合区分转基因水稻及其自交、杂交、回交后代中内、外源GMS2基因并鉴定植株基因型的方法及其应用。
[0008]本专利技术的第三个目的是提供利用上述分子标记预测转基因水稻材料及其自交、杂交、回交后代的花粉育性。
[0009]本专利技术提供的一种鉴别转基因水稻中内、外源GMS2基因的分子标记，其通过核苷酸序列如SEQ ID NO.1
‑
3所示的引物扩增得到。
[0010]本专利技术提供了上述分子标记在鉴定转基因水稻中内、外源GMS2基因型中的应用。
[0011]本专利技术提供了利用上述分子标记预测转基因水稻材料及其自交、杂交、回交后代的花粉育性的应用。
[0012]本专利技术提供了前述分子标记、引物组合或试剂盒在作物育种或种质资源改良中的应用。
[0013]所述的作物包括但不限于水稻、玉米、大豆、小麦、大麦、小米、高粱。
[0014]本专利技术提供的一种用于检测转基因水稻及其自交、杂交、回交后代中内、外源GMS2基因型的引物组合，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1
‑
3所示的引物。
[0015]含有所述引物组合的试剂盒属于本专利技术的保护范围。
[0016]本专利技术的SEQ ID NO.1所示的正向引物F1：GAGCTCGGAGCCGTAGGA，SEQ ID NO.2所示的正向引物F2：GTGAGCACGAGGCAGGTG，和SEQ ID NO.3所示的反向引物R:CCGGAGTACTCGCTGTAC。
[0017]本专利技术上述引物组合是针对野生型GMS2基因(其序列信息记载于中国专利中，专利申请号：202010491115.0)的编码区第118位～126位的AACAGCTAC碱基发生缺失，以及基因编码区第174位与外源GMS2转基因(即育性恢复基因)的SNP多态性(C/G)、第304及305位与外源基因的SNP多态性(AG/TC)设计、筛选后获得。外源GMS2转基因中的两个SNP为人为引入，是同义突变。由于野生型品种中含有该转基因对应的内源基因，本申请在不改变所编码的氨基酸序列的条件下，做这样SNP的引入进行基因修饰，是为了区分植物基因组本身的内源基因与导入的外源基因。本专利技术引入SNP的位置确保在引起功能变化的序列差异位点(即gms2突变位点)的300bp范围内，便于设计引物和控制PCR产物大小。
[0018]引物F1只能与修饰过密码子的外源GMS2转基因配对，引物F2只能与野生型GMS2基因配对，引物R可以与野生型和突变型内源基因配对。此外，F1的3
’
端第四个碱基引入C
→
A的人为错配突变，以便于提高F1和R对目标序列的相对识别能力。
[0019]进一步地，本专利技术提供了一种检测转基因材料及其自交、杂交、回交后代中内、外源GMS2基因及基因型的方法，首先对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的正向引物和SEQ 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别转基因智能不育系材料及其自交、杂交、回交后代中内、外源GMS2基因的分子标记，其特征在于，通过核苷酸序列如SEQ ID NO.1
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3所示的引物扩增得到。2.一种用于检测转基因智能不育系材料及其自交、杂交、回交后代中内、外源GMS2基因的基因型的引物组合，其特征在于，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1
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3所示的引物。3.含有权利要求2所述引物组合的试剂盒。4.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物组合或权利要求3所述的试剂盒在作物育种或种质资源改良中的应用。5.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物组合或权利要求3所述的试剂盒在鉴别转基因智能不育系作物及其自交、杂交、回交后代中内源基因GMS2和外源基因GMS2及内、外源基因不同基因型组合中的应用。6.权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述的作物包括水稻、玉米、大豆、小麦、大麦、小米、高粱。7.检测转基因智能不育系材料GMS2基因型的方法，其特征在于，对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO.1
‑
3所示的引物组合进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳，根据电泳条带确定转基因材料的基因型。8.鉴别转基因智能不育系材料中内、外源GMS2基因的方法，其特征在于，对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO.1
‑
3所示的引物组合进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳，根据电泳条带大小确定转基因材料中的GMS2基因是内源还是外源基因。9.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐杰，龙湍，吴春瑜，李佳林，刘昊，韩晓斌，李新鹏，曾翔，吴永忠，黄培劲，
申请(专利权)人：海南波莲水稻基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：