新型重组痘苗病毒VV-IL-37的构建方法和应用技术

新型重组痘苗病毒VV

【技术实现步骤摘要】
新型重组痘苗病毒VV
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IL
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37的构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及癌症治疗
，具体涉及新型重组痘苗病毒VV
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IL
‑
37的构建方法和应用。

技术介绍

[0002]肝癌是最常见的高致死性的恶性实体肿瘤疾病之一，其治疗一直是临床的重点和难点。由于肝癌具有严重的耐药特性，目前临床使用的化疗药物难以达到可期的治疗效果，且副作用明显。当肝癌病程进入晚期时，现有的治疗手段更是收效甚微。因此，寻找和开发新的治疗药物和手段，是提高肝癌临床治疗效果的关键。
[0003]病毒基因工程药物作为有望大幅提高癌症治疗效果甚至攻克癌症的新型药物，进一步开发和发展此类药物，是突破肝癌临床治疗局限的重要方向之一。

技术实现思路

[0004]基于以上不足，本专利技术提出新型重组痘苗病毒VV
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IL
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37的构建方法，采用该方法构建的重组痘苗病毒VV
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IL
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37
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GFP具有强感染能力和优异的IL
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37基因表达能力，且该新型重组痘苗病毒VV
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IL
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37可用于在制备肝癌药物。
[0005]本专利技术提供如下技术方案，包括以下步骤：
[0006]步骤(一)重组质粒pEGFP
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IL
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37
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N1的构建：经过引物设计、扩增、酶切、琼脂糖凝胶电泳、胶回收、连接、转化、摇菌、质粒提取步骤得到pEGFP
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IL
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37
‑
N1质粒；
[0007]步骤(二)重组痘苗病毒VV
‑
IL
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37/VV
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IL
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37
‑
GFP的生成与包装：
[0008](2.1)取处于对数生长期的293细胞，制备成细胞悬液，然后铺到细胞培养皿中，放入CO2恒温细胞培养箱中培养；
[0009](2.2)用无血清的DMEM细胞培养基配制野生型痘苗病毒工作液，随后，将病毒工作液加入293细胞中，并放于CO2细胞培养箱孵育，使病毒吸附细胞；
[0010](2.3)取1上述pEGFP
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IL
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37
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N1质粒加到离心管中，再依次加入EC buffer和Enhancer buffer，轻轻混匀后，室温放置；
[0011](2.4)向离心管中加入Effectene转染液，用移液枪轻轻吹打混匀后，室温放置；
[0012](2.5)之后向离心管加入DMEM细胞培养基，轻轻混匀，即为质粒转染工作液；
[0013](2.6)取出293细胞，弃掉上清，用PBS轻轻清洗三次，随后，加入质粒转染工作液，再添加DMEM细胞培养基，混匀后，放入CO2细胞培养箱中培养；
[0014](2.7)之后收集细胞上清液，放于离心机中离心1；离心完成后，用滤器过滤细胞上清液，随后，
[0015](2.8)将细胞上清液移入超速离心管中，并置于超速离心机中离心；离心完成后，弃掉上清，加入病毒保存液，充分溶解，即为生成并包装好的重组痘苗病毒VV
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IL
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37/VV
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IL
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37
‑
GFP。
[0016]优选地，步骤(1)中：根据GenBank中IL
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37的序列分别设计用于上下游引物，并引
入双酶切位点。
[0017]优选地，步骤(1)中扩增步骤为：以合成的IL
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37cDNA为模板，用设计的IL
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37特异性引物进行PCR及promega GoTaq DNA聚合酶进行PCR扩增。
[0018]优选地，步骤(1)中酶切步骤为：用限制性内切酶EcoRI和BamH1分别对回收的PCR产物和pEGFP
‑
N1空载体进行37℃双酶切过夜。
[0019]优选地，步骤(1)中转化步骤为：
[0020](1)配制LB固体培养基，放入高压锅灭菌后室温静置2h；
[0021](2)然后向配好的LB固体培养基中加入抗生素；
[0022](3)将以前冻的感受态大肠杆菌DH5α放在冰上，使其慢慢恢复室温；
[0023](4)加入100
‑
200ng质粒，缓慢的用1mL移液枪吹打混匀，整个过程都要在冰上进行，继续孵育30min；
[0024](5)提前打开水浴锅并将其设置为42℃，将上述孵育完毕的感受态大肠杆菌DH5α于42℃水浴锅中孵育90s后，依旧放回冰上冷却2min；
[0025](6)向感受态大肠杆菌DH5α中加入DMEM培养基，打开恒温摇床，将其放在摇床上上孵育45min；
[0026](7)将孵育结束的感受态大肠杆菌DH5α均匀的涂在LB培养基上，倒置于37℃细菌培养箱中过夜培养。
[0027]优选地，步骤(1)中质粒提取步骤为：
[0028](1)将浑浊的菌液倒入离心管中离心，将上清液倒掉；
[0029](2)加入已经提前加入RNaseA的Buffer1，同时用移液枪快速吹打，使其充分混匀裂解；
[0030](3)加入Buffer2，轻柔的上下颠倒至少6次，加入Buffer3，轻柔的上下颠倒至少6次，静置后，离心；
[0031](4)将上清液加入过滤柱中，离心直到所有液体全部过滤；
[0032](5)加入PB溶液，离心，加入W溶液，离心，重复三次；
[0033](6)将过滤柱放入一个干净的离心管上，小心的向柱中心滴加Eluent，室温静置；
[0034](7)将所得溶液放入
‑
20℃保存，所得溶液即为质粒。
[0035]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0036](1)：本专利技术构建的重组痘苗病毒VV
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IL
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37
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GFP具有较强感染能力和优异的IL
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37基因表达能力；
[0037](2)：本专利技术构建的新型痘苗病毒VV
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IL
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37在体外对肝癌细胞增殖具有显著的抑制作用，并增强肝癌细胞的IL
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37表达；
[0038](3)：本专利技术构建的重组痘苗病毒VV
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IL
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37可显著下调STAT3磷酸化水平，进而抑制肝癌细胞的恶性表型；
[0039](4)：本专利技术构建的重组痘苗病毒VV
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IL
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37能够显著抑制肿瘤组织的生长，并且可明显增强肿瘤组织中抑癌细胞因子IL
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37、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.新型重组痘苗病毒VV
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IL
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37的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤(一)重组质粒pEGFP
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IL
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37
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N1的构建：经过引物设计、扩增、酶切、琼脂糖凝胶电泳、胶回收、连接、转化、摇菌、质粒提取步骤得到pEGFP
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IL
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37
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N1质粒；步骤(二)重组痘苗病毒VV
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IL
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37/VV
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IL
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37
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GFP的生成与包装：(2.1)取处于对数生长期的293细胞，制备成细胞悬液，然后铺到细胞培养皿中，放入CO2恒温细胞培养箱中培养；(2.2)用无血清的DMEM细胞培养基配制野生型痘苗病毒工作液，随后，将病毒工作液加入293细胞中，并放于CO2细胞培养箱孵育，使病毒吸附细胞；(2.3)取1上述pEGFP
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IL
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37
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N1质粒加到离心管中，再依次加入EC buffer和Enhancer buffer，轻轻混匀后，室温放置；(2.4)向离心管中加入Effectene转染液，用移液枪轻轻吹打混匀后，室温放置；(2.5)之后向离心管加入DMEM细胞培养基，轻轻混匀，即为质粒转染工作液；(2.6)取出293细胞，弃掉上清，用PBS轻轻清洗三次，随后，加入质粒转染工作液，再添加DMEM细胞培养基，混匀后，放入CO2细胞培养箱中培养；(2.7)之后收集细胞上清液，放于离心机中离心1；离心完成后，用滤器过滤细胞上清液，随后，(2.8)将细胞上清液移入超速离心管中，并置于超速离心机中离心；离心完成后，弃掉上清，加入病毒保存液，充分溶解，即为生成并包装好的重组痘苗病毒VV
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IL
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37/VV
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IL
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37
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GFP。2.根据权利要求1所述的新型重组痘苗病毒VV
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IL
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37的构建方法，其特征在于：步骤(1)中：根据GenBank中IL
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37的序列分别设计用于上下游引物，并引入双酶切位点。3.根据权利要求1所述的新型重组痘苗病毒VV
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IL
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37的构建方法，其特征在于：步骤(1)中扩增步骤为：以合成的IL
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37cDNA为模板，用设计的IL
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37特异性引物进行PCR及promega GoTaq DNA聚合酶进行PCR扩增。4.根据权利要求1所述的新型重组痘苗病毒VV
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IL
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37的构建方法，其特征在于：步骤(1)中酶切步骤为：用限制性内切酶E...

【专利技术属性】
技术研发人员：张致淏，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：