一种人脂肪干细胞转分化为神经干细胞的方法及应用技术

本发明专利技术涉及干细胞医学转化应用技术领域，尤其涉及一种人脂肪干细胞转分化为神经干细胞的方法及应用。本发明专利技术将人原代脂肪干细胞经过化学的小分子和因子诱导分3步法转化为神经干细胞，分化过程中没有利用到细胞重编程技术，没有外源性的干扰细胞的基因组成，保证了转化所得神经细胞的功能性和安全性。本发明专利技术提供的转分化方法及获得的神经干细胞有望成为运用自体干细胞的转化应用在临床工作中进行神经损伤修复及相关神经系统疾病的治疗的一种新手段。种新手段。种新手段。

【技术实现步骤摘要】
一种人脂肪干细胞转分化为神经干细胞的方法及应用


[0001]本专利技术涉及干细胞医学转化应用
，尤其涉及一种人脂肪干细胞转分化为神经干细胞的方法及应用。
技术背景
[0002]脂肪间充质干细胞是目前在干细胞转化应用领域中最受关注的“种子细胞”。脂肪干细胞移植入患者体内后，可生长分化出许多新的正常细胞，如骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，血管内皮细胞，神经细胞等，替代体内病变细胞，修复组织器官损伤，达到治疗疾病的作用。脂肪干细胞还具有免疫调节作用，能够分泌多种细胞因子以及抗凋亡因子、炎性趋化因子等，具有抗氧化、抗炎症能力。脂肪干细胞具有较低的免疫原性，无论宿主与捐献者的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)是否相匹配，移植均可进行。因为脂肪间充质干细胞可以实施自体的干细胞移植应用，在临床转化应用上受到科学家们的青睐，目前已经进入临床实验II期应用于治疗糖尿病，关节损伤，膝关节炎，结肠性息肉，改善心肌缺血，卵巢早衰等。
[0003]与自体的骨髓干细胞比较，骨髓细胞的分离、培养和体外扩增难度很大，细胞培养过程中需要表皮细胞专用培养基，费用昂贵，细胞生长速度缓慢。脂肪干细胞则易培养，在体外培养时生长迅速，分化能力不随培养时间增加而降低，能在低温环境下存活；脂肪源性的神经干细胞体外扩增和分化移植技术具有更高的安全性，而且吸脂术相比骨髓穿刺损伤小、患者痛苦小。
[0004]对脂肪间充质干细胞在治疗神经系统疾病如帕金森，老年痴呆，神经损伤上的应用，发现脂肪细胞可以大量快速的体外扩增，而后将脂肪细胞诱导成为神经细胞回植于患者自体，可以进行有效的治疗。在诱导脂肪干细胞朝向神经方向分化过程中，需要小分子化合物作用于细胞信号传导通路，使细胞重编程，再定向分化。Park等[Park J,Lee N,Lee J,ET Al.Small molecule
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based lineages witch of human adipose
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derived stem cells into neural stem cells and functional GABA corgi neurons.Sci Rep,2017,7(1):10166.]运用TGF
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β受体抑制剂SB431542和选择性BMP信号通路抑制剂LDN 193289分三步进行诱导。使用小分子化合物，将人脂肪干细胞转分化为神经干细胞。最终超过56％的细胞诱导为神经元，而功能性γ氨基丁酸能神经元的诱导效率超过45％。小分子化合物的使用，为脂肪干细胞朝向神经方向分化提供了可重复且有效的方法，但存在一定安全风险。
[0005]到目前为止，未曾有将人原代脂肪干细胞转分化为神经细胞与神经元且无致癌作用的研究报道。

技术实现思路

[0006]为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的之一在于提供一种人脂肪干细胞转分化为神经干细胞的方法。
[0007]本专利技术采用的技术方案如下：
[0008]一种人脂肪干细胞转分化为神经干细胞的方法，该方法将人原代脂肪干细胞培养至第4代，第4代脂肪干细胞在贴壁培养第二天后，加入培养基A培养，培养3天后，细胞形态改变，用NIM神经元诱导培养基培养，每2天更换一次所述NIM神经元诱导培养基；诱导12天后，用NM培养基培养2天，得到所需神经干细胞；
[0009]所述的培养基A配方为：DMEM/F12，体积比10％人的血清替代物、0.5mM I.B.M.X、0.1μM LDN
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193189、20ng/ml FGF、20ng/ml EGF和体积比2％B27；
[0010]所述NIM神经元诱导培养基配方为：DMEM/F12，体积比2％ B27，体积比1％ N2，10μM Foskolin，3μM CHIR99021，0.1μM LDN
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193189，10μMSB431542；
[0011]所述NM培养基配方为：无血清神经基质培养基，体积比2％ B27，体积比1％ N2，10
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50ng/ml BDNF，10ng/ml GDNF。
[0012]优选的，人原代脂肪干细胞培养至第4代的过程为：将人原代脂肪干细胞培养于含10％血清替代物的DMEM培养基中，胰酶消化传代。
[0013]优选的，所述人原代脂肪干细胞培养至第4代的培养条件为：37℃，5％CO2培养，每3～5天更换所述含体积比10％血清替代物的DMEM培养基，并按照培养基体积比例1:3进行传代。
[0014]优选的，所述无血清神经基质培养基StemPro NSC SFM。
[0015]优选的，NM培养基培养2天后，得到的神经干细胞使用NM培养基进行维持培养，每天更换所述NM培养基。
[0016]本专利技术的目的之二在于提供一种诱导得到的神经干细胞，所述的神经干细胞是采用如上所述的方法由人脂肪干细胞转分化得到。
[0017]本专利技术的目的之二在于提供一种如上所述的神经干细胞在制备神经损伤修复的药物或制剂中的应用。
[0018]优选的，所述神经损伤修复是指促进神经损伤的创面愈合和/或改善创面神经系统功能和/或改善退行性神经疾病。
[0019]本专利技术利用人原代脂肪干细胞组织扩增培养3代，对获取的人脂肪干细胞采用化学小分子和细胞因子相结合进行分步诱导，使细胞基因重编程逐步向神经细胞方向转化。本专利技术提供的由脂肪干细胞转化为神经干细胞的过程不包含外源基因整合的细胞重编程、如iPS(induced pluripotent stem cells)的诱导技术采用了含病毒质粒介导的转染等改变细胞基因组成的操作。转录组基因测序结果表明所得神经细胞不仅保留了部分脂肪间充质干细胞的基因组型，而且具有神经干细胞的特性，没有病毒介入细胞，是一种安全，有效的方法。
[0020]通过动物试验对本专利技术制备的神经干细胞进行安全性鉴定，本专利技术神经干细胞注射到裸鼠皮下，经过45天观察，未发现有肿瘤形成，注射产生的细胞肿块，45天后完全吸收与消失，结果证明我们的干细胞安全，无致瘤性。注射经过荧光标记的本专利技术神经干细胞至猴脑内，两个月后能够检测到标记的神经干细胞信号，表明分化的细胞可以在脑内长期存活，发生效益。
[0021]本专利技术的有益效果在于：
[0022]1)本专利技术提供的由脂肪干细胞转分化而来的神经干细胞可以在临床上进行应用或制成干细胞因子等药物。制备神经干细胞过程中，转录组分析中的分化产物中的一些尚
未完全分化成神经干细胞的脂肪干细胞，通过PCR定量分析可能随时间推移在体内逐渐进一步转分化为具有更好分化功能性的神经元。
[0023]2)本专利技术在进行脂肪干细胞转化为神经细胞过程中，未采用任何动物源性的因子成分，而是采用化学小分子改变细胞信号传递通路的方式进行基因重编程技术。诱导其向神经细胞相关通路上转化。通过对分化后细胞进行的基因转录组分析，多巴胺检测，神经干细胞的基因与相关蛋白检测，能够证明本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人脂肪干细胞转分化为神经干细胞的方法，其特征在于，方法具体为：将人原代脂肪干细胞培养至第4代，第4代脂肪干细胞在贴壁培养第二天后，加入培养基A培养，培养3天后，细胞形态改变，用NIM神经元诱导培养基培养，每2天更换一次所述NIM神经元诱导培养基；诱导12天后，用NM培养基培养2天，得到所需神经干细胞；所述的培养基A配方为：DMEM/F12，体积比10％人的血清替代物、0.5mM I.B.M.X、0.1μM LDN
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193189、20ng/ml FGF、20ng/ml EGF和体积比2％B27；所述NIM神经元诱导培养基配方为：DMEM/F12，体积比2％B27，体积比1％N2，10μM Foskolin，3μM CHIR99021，0.1μM LDN
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193189，10μMSB431542；所述NM培养基配方为：无血清神经基质培养基，体积比2％B27，体积比1％N2，10
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50ng/ml BDNF，10ng/ml GDNF。2.如权利要求1所述的一种人脂肪干细胞转分化为神经干细胞的方法，其特征在于，人原代...

【专利技术属性】
技术研发人员：高舒平，江语晨，江鸿超，
申请(专利权)人：晟造源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：