一种三酶级联法生产D-塔格糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种三酶级联法生产D

【技术实现步骤摘要】
一种三酶级联法生产D
‑
塔格糖的方法


[0001]本专利技术涉及一种三酶级联法生产D
‑
塔格糖的方法，属于生物技术的领域。

技术介绍

[0002]稀有糖是自然界中很少存在的单糖和糖醇。D
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塔格糖是D
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果糖的C
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4差向异构体，是一种稀有糖，仅存在于自然界少数物种中。D
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塔格糖的甜度可达蔗糖的92％，但能量仅为等量蔗糖的30％左右，是理想的蔗糖替代品，并且能够有效减少肥胖和糖尿病的发生，消除口腔疾病。
[0003]目前工业上生产D
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塔格糖主要是以D
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半乳糖为底物，经L
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阿拉伯糖异构酶催化生成，但是该方法底物价格昂贵、工艺成本高、反应周期长。亟需寻找一种反应周期缩短，成本低廉且产物得率高的生产D
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塔格糖的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供一种由D
‑
果糖经三酶催化生产D
‑
塔格糖的方法，并通过探究温度、金属离子类型及浓度的影响来使产物收率大幅度增加。本专利技术从低廉的D
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果糖出发，经过磷酸化和去磷酸化合成D
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塔格糖。为提高该方法合成D
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塔格糖的产率，通过实验探究温度、金属离子的类型及浓度对D
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塔格糖合成的影响，最终所得D
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塔格糖得率达67.4％。
[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种三酶催化生产D
‑
塔格糖的方法，所述方法为以果糖为底物，在含有辅因子和ATP的反应体系中，利用果糖激酶(FRK)，D
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塔格糖6
‑
磷酸4
‑
差向异构酶(GatZ)和D
‑
塔格糖
‑6‑
磷酸磷酸酶(MmPase)进行反应生产D
‑
塔格糖。
[0006]在一种实施方式中，所述FRK来源于Clostridium acetobutylicm，所述GatZ来源于Caldilinea aerophila DSM 14535，所述MmPase来源于Methanothermobacter marburgensis。
[0007]在一种实施方式中，编码所述FRK的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述GatZ的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述MmPase的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0008]在一种实施方式中，利用大肠杆菌表达所述FRK、GatZ、MmPase。
[0009]在一种实施方式中，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。
[0010]在一种实施方式中，所述反应温度为40℃～60℃。
[0011]在一种实施方式中，所述辅因子为金属离子。
[0012]在一种实施方式中，所述金属离子为Mg
2+
、Co
2+
、Mn
2+
、Ni
2+
、Cu
2+
或Al
3+
中的一种或一种以上。
[0013]在一种实施方式中，所述金属离子的终浓度为1～4mM。
[0014]在一种实施方式中，所述反应时间为8～24h。
[0015]在一种实施方式中，所述反应体系中还含有缓冲液。
[0016]在一种实施方式中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
[0017]本专利技术第二个目的是提供一种提高D
‑
塔格糖产率的方法，所述方法为向生产D
‑
塔格糖的反应体系中添加辅因子。
[0018]在一种实施方式中，所述辅因子为金属离子。
[0019]在一种实施方式中，所述金属离子为Mg
2+
、Co
2+
、Mn
2+
、Ni
2+
、Cu
2+
或Al
3+
中的一种或一种以上。
[0020]在一种实施方式中，所述金属离子的终浓度为1～4mM。
[0021]在一种实施方式中，所述反应体系包含果糖、ATP、FRK、GatZ和MmPase。
[0022]有益效果：
[0023]本专利技术提供了一种一锅酶法生产D
‑
塔格糖的方法，以果糖为底物，在含有金属离子和ATP的反应体系中，利用来源于Clostridium acetobutylicm的果糖激酶FRK，来源于Caldilinea aerophila DSM 14535的D
‑
塔格糖6
‑
磷酸4
‑
差向异构酶GatZ和来源于Methanothermobacter marburgensis的D
‑
塔格糖
‑6‑
磷酸磷酸酶MmPase进行反应生产D
‑
塔格糖。并通过优化反应条件(温度、金属离子类型及浓度)使D
‑
塔格糖的产率达到原来的2.7～9倍。本专利技术提供的方法反应周期较现有技术有效缩短，只需18h，成本低廉且产物得率高，最终所得D
‑
塔格糖得率达67.4％。
附图说明
[0024]图1：果糖激酶(FRK)，D
‑
塔格糖6
‑
磷酸4
‑
差向异构酶(GatZ),D
‑
塔格糖
‑6‑
磷酸磷酸酶(MmPase)细胞破碎上清液和沉淀的SDS
‑
PAGE分析。其中，M：Blue PlusⅡProtein Marker；1：FRK上清；2：FRK沉淀；3：GatZ上清；4：GatZ沉淀；5：MmPase上清；6：MmPase沉淀；
[0025]图2：不同Mg
2+
浓度对反应的影响；
[0026]图3：温度对反应的影响；
[0027]图4：产物得率时间进程曲线；
[0028]图5：不同金属离子对反应的影响。
具体实施方式
[0029]下述实施例中涉及的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)、pET
‑
28a质粒购自Takara公司、pG
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KJE8购买自宝生物工程(大连)有限公司。
[0030]实施例中涉及的果糖激酶(FRK)来源于Clostridium acetobutylicm，D
‑
塔格糖6
‑
磷酸4
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差向异构酶(GatZ)来源于Caldilinea aerophila DSM 14535，D
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塔格糖
‑6‑
磷酸磷酸酶(MmPase)来源于Methanothermobacter marburge本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种三酶催化生产D
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塔格糖的方法，其特征在于，所述方法为在以果糖为底物，在含有金属离子和ATP的反应体系中，利用果糖激酶FRK，D
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塔格糖6
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磷酸4
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差向异构酶GatZ和D
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塔格糖
‑6‑
磷酸磷酸酶MmPase进行反应生产D
‑
塔格糖；所述FRK来源于Clostridium acetobutylicm，所述GatZ来源于Caldilinea aerophila DSM 14535，所述MmPase来源于Methanothermobactermarburgensis。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述FRK的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述GatZ的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述MmPase的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用大肠杆菌表达所述FRK、GatZ、MmPase。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli BL...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩瑞枝，刘双玉，涂文雨，倪晔，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：