一种人胰岛素样生长因子检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术主要关于一种人胰岛素样生长因子检测方法及试剂盒，方法包括：蛋白解离；蛋白沉淀；固相萃取纯化：质谱检测：上样LC

【技术实现步骤摘要】
一种人胰岛素样生长因子检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术主要关于医学检测
，特别是关于一种人胰岛素样生长因子检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]生长激素缺乏症(GHD)是引起儿童身材矮小的疾病，大多是由于垂体分泌生长激素(GH)不足而引起的，临床表现为身材矮小，智力正常，骨骼生长缓慢等症状，且其骨龄落后于正常同龄儿童，同时还能引起骨代谢、糖代谢的改变，严重影响儿童的生长。
[0003]GHD诊断目前无金标准，实验室检查以GH激发试验为主要诊断依据，但GH不稳定，呈脉冲式及有昼夜节律，需要注射药物激发才能有较高水平得分。GH激发试验需要2小时内要抽血5次，重复性及准确性欠佳、影响因素多。血清IGF
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I(人胰岛素样生长因子
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I)因无明显脉冲式分泌和昼夜节律，相对稳定，能较好地反映内源性GH分泌状态，因此一度被认为是GHD的筛查指标。临床对GHD初诊患者或进行身高监测的就诊者一般先行IGF
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I和IGFBP
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3(人胰岛素样生长因子结合蛋白3)的检查，结合此两项结果与临床表现，怀疑为GHD时再行GH检测。
[0004]人胰岛素样生长因子(IGF)是一组具有促生长作用的多肽类物质，其分泌细胞广泛分布在人体肝、肾、肺、心和肠等组织中，IGF族有IGF
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I和IGF
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II(人胰岛素样生长因子
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II)两种，IGF
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I是由第12号染色体的基因编码的含有70个氨基酸的碱性肽，结构与胰岛素相似，可以介导GH对机体的促生长作用，其促生长作用强，是儿童期的重要的生长因子，各组织中合成的IGF
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I多以自内分泌或旁分泌方式发挥其促生长作用，研究表明，IGF
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I、IGFBP
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3水平变化与GHD密切相关；IGF
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II的类胰岛素作用更强，其为包含67个氨基酸的单链肽，对胎儿生长起重要作用，早期一些文章表明在判断儿童是否罹患GHD时，IGF
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I/IGF
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II性能优于IGF
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I单检或IGF
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I+IGFBP
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3双检性能。
[0005]目前市场上IGF
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I检测常用的检测方法为化学发光法，IGFBP
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3的检测主要是由于血液中95%的IGF
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I是与其结合的，目前的化学发光法即使在检测前进行处理，也依然避免不了IGFBP
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3的影响。同时目前的检测方法检测限为25ng/mL，而低龄儿童血液中的IGF
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I含量通常在10ng/mL以下，因此该方法存在检限缺陷。质谱法检测IGF
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I一方面可避免IGFBP
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3的影响，实现IGF
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I的精准定量，有望省去IGFBP
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3检测；另一方面其检测限可达10ng/mL以下，从而实现低浓度IGF
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I的检出。IGF
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II是GH
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IGF轴中的一环，理论上可能影响GH
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IGF轴从而影响GH的分泌，有研究显示在判断儿童是否为GHD时，IGF
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I/IGF
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II性能优于IGF
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I单检或IGF
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I+IGFBP
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3性能。因此同时进行IGF
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I与IGF
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II的定量检测可帮助临床更好的筛选出GHD患者，从而得到有效治疗。
[0006]现有技术中对IGF
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I和/或IGF
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II的定量检测专利较少，目前只有融智生物的申请号为202210059159、专利技术名称为一种基于MALDI
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TOF+MS的胰岛素样样生长因子
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I的定量检测试剂盒及检测方法的专利，以及奎斯特诊断投资公司的授权公告号为CN105067698B及CN102596230B的专利技术专利申请。其中融智生物的专利技术主要是基于MALDI
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TOF技术IGF
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I的检
测定量，其定量根据该类质谱的特征采用了非线性拟合的方式；此外在裂解液(解离剂)的选择中，多考虑蛋白变性剂和表面活性剂，其保护范围不涉及三氟乙醇这类试剂，且需要抗体富集，与我们正在研究建立的方法学差异较大；从流程上看，实验较为繁琐，涉及到抗体与磁珠的结合、目标蛋白富集、洗涤和重悬等步骤，在制备抗体磁珠键合时还需要用到超滤管等耗材以及抗体、靶标板等物料。奎斯特诊断投资公司专利主要基于MALDI
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TOF技术定量，其定量根据该类质谱的特征采用了非线性拟合的方式，此外在裂解液(解离剂)的选择中，多考虑蛋白变性剂和表面活性剂，且需要抗体富集，其主要技术要点集中在在线SPE分离纯化和用高分辨质谱定量IGF
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I。
[0007]前述
技术介绍
知识的记载旨在帮助本领域普通技术人员理解与本专利技术较为接近的现有技术，同时便于对本申请专利技术构思及技术方案的理解，应当明确的是，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日前已公开的情况下，上述
技术介绍
不应当用于评价本申请技术方案的新创性。

技术实现思路

[0008]为解决上述
技术介绍
中提及的至少一种技术问题，本专利技术的目的旨在提供基于LC
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MS/MS同时检测IGF
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I和IGF
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II的方法及试剂盒，方法显著降低了前处理工艺的复杂程度，能同时检测IGF
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I和IGF
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II，方法灵敏度高，特异性强，准确度好，精密度高，检测时间短，检测通量高。
[0009]提供一种人胰岛素样生长因子检测方法，包括：蛋白解离：待测样本中加入解离剂和标准内标液进行蛋白解离；蛋白沉淀：解离完成的样本溶液中加入沉淀剂，取上清备用；固相萃取纯化：上样至SPE板，依次进行淋洗、洗脱；质谱检测：上样LC
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MS/MS检测，获得待测样本的Area Ratio值；计算：以标准品工作液替换待测样本重复进行前述蛋白解离、蛋白沉淀、固相萃取纯化、质谱检测步骤，获得标准曲线，将待测样本的Area Ratio值代入标准曲线计算出IGF
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I和IGF
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II的含量；其中，所述标准内标液包括IGF
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I的同位素标记稀释液；所述标准品工作液中包括IGF
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I和IGF
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II的不同浓度稀释液，且IGF
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I和IGF
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II的浓度不同。
[0010]本专利技术还提供一种人胰岛素样生长因子检测试剂盒，所述试剂盒能同时定量检测IGF<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人胰岛素样生长因子检测方法，其特征在于包括：蛋白解离：待测样本中加入解离剂和标准内标液进行蛋白解离；蛋白沉淀：解离完成的样本溶液中加入沉淀剂，取上清备用；固相萃取纯化：上样至SPE板，依次进行淋洗、洗脱；质谱检测：上样LC
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MS/MS检测，获得待测样本的Area Ratio值；计算：以标准品工作液替换待测样本重复进行前述蛋白解离、蛋白沉淀、固相萃取纯化、质谱检测步骤，获得标准曲线，将待测样本的Area Ratio值代入标准曲线计算出IGF
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I和IGF
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II的含量；其中，所述标准内标液包括IGF
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I的同位素标记稀释液；所述标准品工作液包括IGF
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I和IGF
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II的系列浓度稀释液，且IGF
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I和IGF
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II的浓度不同。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述解离剂是TFE、SDS或CHAPS中的至少一种。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述沉淀剂是乙酸乙腈、甲醇、乙醇或乙腈中的至少一种。4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：所述标准品工作液包括：浓度为8、24、80、200、600、1200ng/mL的IGF
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I溶液；和浓度为12、36、120、300、900、1800ng/mL的IGF
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II溶液。5.一种人胰岛素样生长因子检测试剂盒，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑坚，司慧娟，姜宽，
申请(专利权)人：西湖欧米杭州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：